نویسندگان
1 کارشناس ارشد ژنتیک، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
2 دانشیار ژنتیک، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
چکیده
کلیدواژهها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Two polymorphic markers including BglII and EcoRI, were identified at intron 1 and intron 5 of PAH gene. In order to test whether these polymorphisms are behaving as neutral alleles or are being subjected to selective pressures in Isfahan population, 110 individuals were genotyped by PCR-RFLP. The Arlequin input file was prepared by use of phase-known haplotype data and Neutrality tests (Tajima D test and Fuâs Fs test) were done using Arlequin program. 42 individuals were found heterozygous for both polymorphisms whose haplotype phase remained unknown. The BglII-EcoRI haplotype phase was known only at 68 individuals who were used for preparation of input file. Tajima's D value and Fs value at Isfahan population were 1.7 and 1.02, respectively. Positive values of Fs and D>0 indicated that these polymorphisms are under selection pressure at Isfahan population. Although these polymorphisms were in the non-coding region of PAH gene, but these were not neutral alleles and positive values of these tests provided evidence for balancing selection of these polymorphisms at Isfahan population. The results of this study could improve our understanding of evolutionary history and structure of Isfahan population.
کلیدواژهها [English]
مقدمه
مطابق با تئوری مولکولی تکامل خنثی، اکثر چندشکلیهای DNA از لحاظ انتخاب خنثی هستند و تغییر در فراوانی آللی این لوکوسها به دلیل رانش ژنتیکی تصادفی و به ندرت به دلیل انتخاب است. امروزه آزمونهای Neutrality متعددی توسعه یافته است که با استفاده از آنها میتوان جایگزینیهای نوکلئوتیدی را که به مانند آللهای خنثی عمل میکنند و یا در معرض فشار انتخاب در یک جمعیت قرار دارند بررسی کرد. یکی از آزمونهای Neutralityکه برای بررسی اثر فشار انتخاب بر روی یک ژن به کار برده میشود، D تاجیما(Tajima’ D)| است. این آزمون بر اساس مقایسه تنوع نوکلئوتیدی حاصل از تعداد و تنوع نوکلئوتیدی حاصل از فراوانی اللی جایگاههای چند شکلی استاز جمله آزمونهای Neutrality دیگری که برای مطالعه تأثیر انتخاب بر روی یک ژن به کار برده میشود، آزمون Ewens-Watterson (آزمون E-W) است. با استفاده از آزمون E-W میتوان بررسی کرد که اثر انتخاب بر روی یک ژن در جمعیت جهتدار یا متعادل است (Watterson, 1978).
ژن فنیل آلانین هیدرکسیلاز (Phenylalanine Hydroxylase, PAH)|، آنزیم فنیلآلانین 4- مونوهیدروکسیلاز را کد میکند که تبدیل غیر قابلبرگشت فنیلآلانین به تیروزین را بر عهده دارد. این آنزیم به طور طبیعی در کبد بیان میشود که بیان آن با مقدار کمتری در کلیه هم مشاهده شده است. از آن جهت که هیدروکسیلاسیون فنیلآلانین، مرحله محدودکننده سرعت در کاتابولیسم فنیلآلانین است، کمبود آنزیم فنیل آلانین هیدروکسیلاز باعث بروز فنوتیپ PKU میگردد
(Kwok et al. and 1985; Madden, 2004). از جمله چندشکلیهایی که در ناحیه ژن PAH شناسایی شده است، مارکرهای چندشکلی با طول قطعات محدودکننده (RFLP) است. مارکرهای پلی مورف موجود در ناحیه ژنی با توجه به پیوستگی کاملی که با ژن PAH دارند، دارای کاربرد فراوانی در تحلیل پیوستگی ژن با جهشهای ژنی هستند (Fazeli and Vallian, 2009). از جمله کاربرد آنها میتوان به شناسایی ناقلان بیماری در خانوادههای افراد بیمار اشاره نمود (Dworniczak et al., (1991.
با توجه به تفاوت فراوانی آللی و درجه هتروزیگوتی پلیمورف در جمعیتهای مختلف، ضروری است قبل از به کارگیری مارکرهای مزبور، وضعیت آنها در جمعیت مورد مطالعه، مورد بررسی دقیق جمعیتشناختی قرار گیرد. در این مطالعه، دو مارکر چندشکلیBglII و EcoRI که به ترتیب در اینترون 1 و اینترون 5 ژنPAH قرار دارند (شکل 1) برای مطالعه آزمون Neutrality در جمعیت اصفهان انتخاب شدند. نتایج این مطالعه میتواند درک ما را از اثر فشار انتخاب بر روی ژن PAH در جمعیت اصفهان افزایش دهد.
شکل 1- جایگاه مارکرهای چندشکلیBglII و EcoRIکه به ترتیب در اینترون 1 و اینترون 5 ژنPAH قرار دارند. ژن PAHدارای 13 اگزون است. اگزونها در ژن PAHبا اعداد 13-1 مشخص شدند.
مواد و روشها
تهیه نمونه
در این مطالعه، نمونه خون از 110 فرد غیرخویشاوند از جمعیت اصفهان گرفته شد که زیرمجموعهای از جمعیت اصفهان هستند. بنابراین، نتایج به دست آمده را میتوان به تمام جمعیت اصفهان نسبت داد.
استخراج DNA ژنومی و انجامPCR
از نمونههای خونی تهیه شده، DNA ژنومی با روش اصلاح شده استاندارد رسوب نمک استخراج شد (Miller et al., 1988). پس از آن، ناحیه مربوط به دو مارکر ژن PAH،PAH-BglII و PAH-EcoRI، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر شد (Dworniczak et al., 1991; Kidd, 2002). واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر شامل 50 نانوگرم DNA ژنومی، 10 پیکو مول از هر پرایمر، 5/2 واحد آنزیم Taq پلیمراز و مخلوط dNTP در غلظت نهایی 10 میلی مولار، در بافر 10X همراه PCR و MgCl2 انجام شد. پس از آن ژنوتیپ محصولات PCR بر روی ژل آگاروز 5/1% تعیین شد.
هضم آنزیمی محصول PCR
پس از انجام PCR، به منظور تعیین حضور یا عدمحضور جایگاه شکست آنزیمهای BglII و EcoRI، هضم آنزیمی بر روی محصولات تکثیر جایگاههایBglII و EcoRI انجام شد. هضم آنزیمی محصول PCR با هر کدام از این آنزیمها بدین صورت انجام شد که به یک ویال 10 میکروگرم از نمونه DNA محصول PCR به همراه 5 واحد از آنزیم (5/0 میکرولیتر از آنزیم) و 5/2 میکرولیتر بافر اضافه گردید و با آب دو بار تقطیر به حجم 25 میکرولیتر رسانده شد. ویال حاوی مخلوط واکنش هضم آنزیمی به مدت یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد در بن ماری قرار داده شد تا هضم آنزیمی کامل گردد. محصولات هضم آنزیمی توسط الکتروفورز با ژل 5/1 درصد آگاروز بررسی گردید (Fazeli and Vallian, 2009).
آنالیزهای آماری
اطلاعات اولیهای که برنامه Arlequin برای تخمین آزمون Neutrality استفاده میکند، باید از نوع توالی DNA یا اطلاعات مربوط به مارکرهای RFLPبا فاز گامتی شناخته شده باشند (Schneider et al., 2000). در این مطالعه، از اطلاعات هاپلوتیپی با فاز گامتی شناخته شده دو مارکر RFLP برای تخمین آزمونهای Neutrality (آزمونهای D تاجیما و Fu’s Fs و آزمون E-W) در جمعیت اصفهان استفاده گردید. همچنین با استفاده از همین برنامه، هتروزیگوسیتی مورد انتظار و هتروزیگوسیتی مشاهده شده این دو مارکر در جمعیت اصفهان تخمین زده شد.
مشاهدات
امروزه به منظور بررسی اثر فشار انتخاب بر روی یک ژن در جمعیت از آزمونهای Neutrality استفاده میگردد. در این مطالعه از اطلاعات هاپلوتیپی BglII-EcoRI در ژن PAH برای تخمینD تاجیما، Fs و اجرای آزمون E-W (آزمونهای Neutrality ) استفاده گردید. مارکرهای BglII و EcoRI به ترتیب در اینترون 1 و اینترون 5 ژنPAH قرار دارند (شکل 1). تخمین فاز هاپلوتیپی با استفاده از تعیین ژنوتیپ دو مارکر BglII و EcoRI در 110 فرد غیر خویشاوند انجام گرفت. تکثیر ناحیه مربوط به مارکر BglII و EcoRI به ترتیب قطعهای با طول 290 و 458 جفت بازی تولید کرد که در صورت حضور جایگاه شکست آنزیم BglIIو EcoRI به ترتیب به قطعاتی با طول 209 و 81 جفت بازی و طول 412 و 46 جفت بازی شکسته شدند (شکل 2).
فاز گامتی هاپلوتیپ BglII-EcoRI مشاهده شده در 110 فرد مورد مطالعه در جمعیت اصفهان در جدول 1 نشان داده شده است. برای هر هاپلوتیپ اعداد از چپ به راست به ترتیب نشاندهنده آلل BglII، EcoRI در ژن PAH است. برای مارکرهای BglII و EcoRIاعداد 1 و 0 به ترتیب حضور (+) و عدمحضور(-) جایگاه شکست آنزیم محدودکننده را مشخص میکند. در اطلاعات ژنوتیپی، اعداد 0، 1 و 2 به ترتیب برابر با ژنوتیپهای -/-، +/+ و +/- است. با استفاده از اطلاعات ژنوتیپی، تنها فازگامتی هاپلوتیپ BglII-EcoRIدر 68 فرد تعیین گردید. ژنوتیپ 42 فرد مورد مطالعه در هر دو مارکر BglII و EcoRI هتروزیگوت بود. بنابراین، فاز هاپلوتیپی در این افراد ناشناخته باقی ماند.
شکل 2- بررسی وضعیت ژنوتیپی مارکرهای Eco RI و Bgl IIدر جمعیت اصفهان
تعیین ژنوتیپ(A مارکر IIBgl ، (BEcoRI.به منظور بررسی وضعیت ژنوتیپی مارکرهای مزبور DNA ژنومی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر شده و سپس توسط آنزیمهای محدود کننده مورد هضم قرار گرفته است. چنانکه در شکل نشان داده شده است، اطلاعات ژنوتیپی برای افراد هموزیگوت منفی، هموزیگوت مثبت و هتروزیگوت به ترتیب به صورت -/-، +/+ و +/- نشان داده شدهاند. M نشاندهنده مارکر اندازه است. برای اطلاعات بیشتر به متن رجوع شود.
جدول 1- فازهای گامتی هاپلوتیپ BglII-EcoRIمشاهده شده در 110 فرد مورد مطالعه جمعیت اصفهان
|
فراوانی (تعداد افراد) |
فازهای گامتی هاپلوتیپ |
اطلاعات ژنوتیپی |
|
5 |
11 10 |
12 |
|
|
42 |
01 00 |
02 |
|
|
12 |
11 01 |
21 |
|
|
1 |
10 10 |
10 |
|
|
2 |
10 00 |
20 |
|
|
2 |
00 00 |
00 |
|
|
4 |
01 01 |
01 |
|
|
42 |
نامشخص |
22 |
|
|
اطلاعات هاپلوتیپی 68 فرد که فاز گامتی آنها مشخص بود، برای تهیه فایل ورودی برنامه Arlequin استفاده گردید و مقدار D تاجیما و Fu’s Fs در جمعیت اصفهان به ترتیب برابر با 7/1 و 02/1 تخمین زده شد. مقدار F موردانتظار و مشاهده شده در آزمون E-W برابر با 35/0 و 59/0 تخمین زده شد. برای تخمین هتروزیگوسیتی مشاهده شده و هتروزیگوسیتی مورد انتظار این دو مارکر در جمعیت اصفهان از اطلاعات ژنوتیپی110 فرد استفاده گردید. میزان هتروزیگوسیتی موردانتظار و هتروزیگوسیتی مشاهده شده دو مارکر BglII و EcoRI در جمعیت اصفهان که با استفاده از برنامه Arlequin تخمین زده شد، در جدول 2 نشان داده شده است.
جدول 2: درجه هتروزیگوسیتی چندشکلیهای BglII و EcoRI در ژن PAH در جمعیت اصفهان
چندشکلی |
هتروزیگوسیتی مورد انتظار |
هموزیگوسیتی مورد انتظار |
هتروزیگوسیتی مشاهده شده |
هموزیگوسیتی مشاهده شده |
PAH-BglII |
43% |
57% |
51% |
49% |
PAH-EcoRI |
50% |
50% |
81% |
19% |
نتیجهگیری و بحث
در این مطالعه، از اطلاعات هاپلوتیپی BglII-EcoRI در ژن PAH برای بررسی اثر انتخاب بر روی این ژن در جمعیت اصفهان استفاده گردید. اگر چه هر دو این چندشکلیها درناحیه غیرکدکننده ژن PAH قرار دارند و به نظر میرسد که تئوری خنثی در مورد آنها صدق می کند، ولی تخمین مقدار D تاجیما و Fu’s Fs نشان میدهد که این چندشکلیها در جمعیت اصفهان از نظر انتخاب خنثی نیستند. مقدار مثبت هر دو آزمون بیانگر آن است که این چندشکلیها در جمعیت اصفهان تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارند یا به تازگی تحت تأثیر مانع جمعیتی قرار گرفتهاند.
موانع جمعیتی، فرآیندهای تکاملی هستند که مانع تولیدمثل درصد بالایی از جمعیت میگردند. موانع جمعیتی میتواند باعث افزایش درونزادآوری یا اثر بنیانگذار گردد (Pasternak, 2005) که معمولا باعث کاهش هتروزیگوسیتی میگردند. در جمعیت مورد مطالعه، هتروزیگوسیتی مشاهده شده چندشکلی BglII تقریبا با هموزیگوسیتی مشاهده شده برابر است و هیچ کاهشی در هتروزیگوسیتی نسبت به هموزیگوسیتی مشاهده نمیشود. در مورد چندشکلی EcoRI، هتروزیگوسیتی در جمعیت اصفهان فراوانی بالاتری نسبت به هموزیگوسیتی دارد، بنابراین، به نظر نمیرسد که مانع جمعیتی نقش مهمی را در مثبت بودن مقدار آزمون D تاجیما و Fu’s Fs در جمعیت اصفهان داشته باشد.
انتخاب متعادل مربوط به فرآیندهای انتخابی است که چندین آلل مختلف یک ژن در استخر ژنی یک جمعیت در فراوانی بالا حفظ میگردد. در این شرایط، معمولا هتروزیگوتها سازگاری زیستی و تولید مثلی بالاتری نسبت به هموزیگوتها را دارا هستند .(Schneider et (al., 2000 همانطور که در جدول 2 مشاهده میشود، هتروزیگوسیتی مشاهده شده چندشکلی EcoRI در ژن PAH در جمعیت اصفهان بسیار بالاتر از هتروزیگوسیتی مورد انتظار این مارکر است که شاهدی بر انتخاب متعادل بر روی چندشکلی EcoRI در ژن PAH در جمعیت اصفهان است. با وجود اینکه چندشکلی EcoRIدر اینترون 5 ژن PAH (ناحیه غیرکدکننده) قرار دارد، ولی به نظر میرسد که افراد هتروزیگوت در چندشکلی EcoRI سازگاری زیستی بالاتری نسبت به افراد هموزیگوت دارند. در واقع، نتایج حاصل از آزمونهای Neutrality به همراه مقایسه نتایج حاصل از تخمین هتروزیگوسیتی مورد انتظار و هتروزیگوسیتی مشاهده شده، مؤید آن است که چندشکلی EcoRI در جمعیت اصفهان تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارد.
آزمون دیگری که به طور گسترده در ژنتیک جمعیت به منظور تخمین اثر انتخاب بر روی یک ژن به کار برده میشود، آزمون E-W است. در این آزمون، مجموع هموزیگوسیتی مشاهده شده برای هر هاپلوتیپ در یک لوکوس (Fo) با مجموع هموزیگوسیتی مورد انتظار برای هر هاپلوتیپ در یک لوکوس (Fe) مقایسه میگردد. در صورتی که ژنی تحت تأثیر انتخاب خنثی، تکامل یابد، مقدار Fo با Feبرابر خواهد بود. مقدار Foو Fe برای هاپلوتیپ BglII-EcoRI در ژن PAH در جمعیت اصفهان برابر با 35/0 و 59/0 تخمین زده شد. از آن جهت که مقدار Fe هاپلوتیپ BglII-EcoRI در ژن PAH در جمعیت اصفهان بزرگتر از مقدار Fo است، بنابراین، می توان نتیجهگیری کرد که این هاپلوتیپ در ژن PAH در جمعیت اصفهان تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارد.
اگر چه نتایج مطالعه حاضر بر روی چندشکلیهای BglII و EcoRI در ژن PAH میتواند درک ما را از تاریخچه تکاملی و ساختار ژنتیکی جمعیت اصفهان افزایش دهد، البته لازم است تا مطالعات بیشتری بر روی ژنهای مختلف در جمعیت اصفهان انجام شود تا بصیرت ما در مورد ساختار ژنتیکی جمعیت اصفهان، که یکی از بزرگترین جمعیتهای ایران است، افزایش یابد.