Phytoplasma Classification Methods

مقدمه

فایتوپلاسماها، پروکاریوت‌‌های بدون دیوارة سلولی هستند که تنها در بافت زندة میزبان‌‌های گیاهی و حشرات ناقل خود رشد می‌‌کنند و در سال ۱۹۶۷ توسط دانشمندان کشف و به نام ارگانیسم‌های شبیه‌‌مایکوپلاسما نامیده شدند. امکان کشت فایتوپلاسماها در محیط آزمایشگاه وجود ندارد و همین مسئله باعث محدودشدن اطلاعات دربارۀ آنها شده است؛ اما با این وجود، اخیراً در مرحلۀ آزمایشگاهی، رشد فایتوپلاسما در محیط کشت مصنوعی اثبات شده است (Contaldo et al., 2016). این پروکاریوت‌‌های بیمارگر گیاهان، برخلاف باکتری‌‌ها بدون دیوارة سلولی هستند (Kuske and Kirkpatrick, 1992; Toth et al., 1994; Schweigkofler, 2008). عامل بیماری‌‌های مهمی ازجمله جاروک لیموترش (Bove et al., 2000)، جاروک بادام (Salehi et al., 2006; Ghayeb Zmaharir, 2014)، جاروک یونجه (Esmailzadeh- Hosseini, 2016)، زردی و زوال انگور (Ghayeb Zamharir et al., 2017)، گل‌‌سبز (فیلودی) کنجد (Salehi et al., 2016)، جوانه‌‌بزرگی گوجه فرنگی (Jamshidi et al., 2014)، زردی هلو (Zirak et al., 2010; Ghayeb Zamharir, 2014)، زردآلو (Salehi et al., 2018) و خرما (Ghayeb Zamharir and Eslahi, 2019)، بیماری‌‌های فایتوپلاسمایی پسته (Ghayeb Zamharir, 2016) و چند بیماری دیگر که از کشورمان گزارش شده، همگی فایتوپلاسمایی است. عامل تعدادی از این بیماری‌‌ها متفاوت است با آنچه در سایر نقاط دنیا گزارش شده است. یکی از دلایل این تنوع ممکن است جغرافیای ایران باشد؛ زیرا ازنظر اقلیمی و ژئومورفولوژیکی یکی از ناهمگن‌‌ترین مناطق آسیا است و این موضوع منجر به تنوع گیاهان ایران شده است (Saberamoli et al., 2021; Bagheri et al., 2021; Mehrnia et al., 2021).

طبقه‌‌بندی این موجودات تنها براساس یک ویژگی بیولوژیک، یعنی فقدان دیوارة سلولی، کافی نیست و ممکن است گمراه‌‌کننده باشد؛ برای مثال Thermoplasma acidophilum پروکارویوتی فاقد دیوارة سلولی است و در ابتدا در ردۀ مالیکیوت‌‌ها قرار داشت؛ اما مطالعات مولکولی و بیوشیمیایی تکمیلی نشان داد این موجود به قلمروی آرکه‌‌آ‌‌ یا باکتری‌‌های باستانی (Archaea) تعلق دارد (Lim and sears, 1989).

موجودات زنده در سه قلمروی باکتری‌‌های حقیقی (Eubacteria)، آرکه‌‌آها و یوکاریوت‌‌ها (Eucarya) قرار گرفته‌‌اند که دو قلمروی آن (باکتری‌‌ها و آرکه‌‌آ) متعلق به پروکاریوت‌‌ها است (Woese et al., 1987). در سال 2015 موجودات زنده به دو سلسلۀ پروکاریوت‌‌ها و یوکاریوت‌‌ها تقسیم شد (Ruggiero et al., 2015). فایتوپلاسماها در قلمروی باکتری‌‌ها (Bacteria)، شاخة تنریکیوت‌‌ها (Tenericutes)، ردة مالیکیوت‌‌ها (Mollicutes)، راستة آکوله‌‌پلاسماتالس (Acholeplasmatales) و خانوادة آکوله‌‌پلاسماتاسه (Acholeplasmataceae) قرار دارند (Schweigkofler, 2008; Ruggiero et al., 2015; Perez-López et al., 2016; Zhao and Davis, 2016).

گروه‌‌بندی فایتوپلاسماها

در دهه‌‌های 1980 و 1990 طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها با تولید آنتی‌‌بادی‌‌های تک‌‌دودمانی و چنددودمانی انجام می‌‌شد. به‌‌تدریج، با تهیة نشانگر DNA مخصوص فایتوپلاسماها، انجام آنالیزهای RFLP (Restriction Fragment Leght Polymorphism) و هیبریداسیون DNA-DNA، روش تشخیص فایتوپلاسماها دقیق‌‌تر شد و چند خوشه (کلاستر (Cluster)) و زیرخوشه (زیرکلاستر (Subcluster)) مجزای ژنومیکی از فایتوپلاسماها (مثل خوشۀ زردی مینا با سه زیرخوشه و خوشۀ بیماری X هلو با هفت زیرخوشه) معرفی شد. در دهة گذشته، روش‌‌هایی برپایة بیولوژی و ژنتیک مولکولی، مانند مقایسة توالی نوکلئوتیدی بخشی از RNA ریبوزومی، این امکان را فراهم کرده است که نخست، ارتباط بین علائم بیماری و عامل یا عوامل بیماری به‌‌طور دقیق‌‌تری تعیین شود و سپس روابط تکاملی و فیلوژنی بین جدایه‌‌های مختلف فایتوپلاسماها با یکدیگر و با سایر پروکاریوت‌‌ها واقع‌‌بینانه‌‌ترمشخص شود؛ اما بیشترین پیشرفت در این زمینه با مقایسة توالی نوکلئوتیدی بخشی از ژن S rRNA16 یا ناحیة بین ژنی S16- S23 و tRNA-Ile انجام شده است (Lim and Sears, 1989). این روش هنوز برای آنالیز تعداد زیادی از فایتوپلاسماهای ناشناخته (در مقیاس وسیع) استفاده می‌‌شود. گروه‌‌بندی دقیق‌‌تر زیرخوشه‌‌ها با استفاده از مناطق کمتر محافظت‌‌شده، مانند ژن کدکنندة پروتئین ریبوزومی و ناحیۀ بین ژن‌‌های S16- S23 و tRNA-Ile انجام می‌‌شود.

طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها براساس ژن S rRNA16

در پژوهش‌‌های جدید، طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها براساس مقایسة توالی ژن S rRNA16 صورت می‌‌گیرد (Bertaccini et al., 2014; Zhao and Davis 2016). آنالیزهای RFLP (هضم فرآورده‌‌های حاصل از انجام واکنش زنجیره‌‌ای پلی‌‌مراز روی ژن S rRNA16) با استفاده از آنزیم‌‌های برشی خاص، در فایتوپلاسماهای مختلف نقوش متفاوتی را تشکیل می‌‌دهد که آنها را از یکدیگر متمایز می‌‌سازد. ثابت شده است این روش، ساده، مطمئن و کاربردی است (Bertaccini et al., 2014).

بر‌‌اساس آنالیز RFLP روی فرآورده‌‌های حاصل از انجام واکنش زنجیره‌‌ای پلی‌‌مراز ‌‌روی ژن S rDNA16 توسط Lee و همکاران (1992)، 10 خوشه و 15 زیرخوشه برای فایتوپلاسماها تعیین شد. درحال حاضر، فایتوپلاسماها به 34 گروه (Zhao and Davis, 2016) و 46 جنس کاندید تقسیم شده‌‌اند که اسامی این جنس‌‌ها در جدول 1 آورده شده است.

جدول 1- فهرست گونه‌‌های فایتوپلاسما (Candidatus Phytoplasma) که تاکنون معرفی شده‌‌اند.

طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها براساس ناحیة بین ژنی S16 و S23

ناحیة بین ژنی rRNA S23- S16 فایتوپلاسماها که حدود 232 جفت باز (bp) است، دارای قسمتی است که tRNAIle (tRNA مربوط به انتقال اسیدآمینۀ ایزولوسین و بسیار محافظت‌‌شده است.) را کد می‌‌کند؛ با ‌‌این حال توالی جانبی که از tDNAIle به S rDNA16 و بهS rDNA 23 امتداد دارد، در میان فایتوپلاسماهای مختلف بسیار متنوع است. به‌‌دلیل محدود‌‌بودن اطلاعات موجود در توالی به‌‌نسبت کوتاه، ناحیة بین ژنی rRNA S16- S23، تمام زیرگروههای Sr16 را متمایز نمی‌‌کند؛ به عبارت دیگر چندین‌‌بار ثابت شده است ترکیب بررسی‌‌های ژنS rRNA 16به‌‌علاوة توالی ناحیة بین ژنی S rRNA23- S16 برای تمایز انواع جدایه‌‌های بین یک زیرگروه Sr16 مناسب است (Griffiths et al., 1999; Padovan et al., 2000; Marcone et al., 2001; Andersen et al., 2006).

طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها براساس ژن tuf

ژن tuf نیز برای طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها استفاده می‌‌شود. این ژن، فاکتور طویل‌‌شدن Tu (EF-Tu) را در خلال فرآیند تولید پروتئین کد می‌‌کند و نقشی محوری در جریان ترجمة ژن‌‌ها بر عهده دارد. با بررسی توالی EF-Tu ثابت شده است که این ژن نیز در مطالعات فیلوژنتیک کارآمد و نتایج حاصل از بررسی این فاکتور با نتایج مطالعات S rRNA16 قیاس‌‌شدنی است (Schneider et al.,1997). توالی ژن tuf برای دو استرین از فایتوپلاسمای زردی مینا و فایتوپلاسمای عامل بیماری X هلو تعیین شده است. مطالعات ساترن‌‌بلات نشان می‌‌دهد این ژن به‌‌صورت تک‌‌نسخه در فایتوپلاسماها وجود دارد (Schneider et al., 1997). تشابه توالی نوکلئوتیدی ژن tuf در میان گروه زردی مینا، بیماری X هلو و جوانه‌‌بزرگی بین 8/87 تا 97 درصد است (Schneider et al., 1997; Marcone et al., 2000). گروهها و زیرگروههای فایتوپلاسمایی براساس هضم آنزیمی این ناحیه با چند آنزیم تفکیک می‌‌شود (Schneider et al., 1997; Marcone et al., 2000). کارایی این روش در تفکیک فایتوپلاسماها کمتر از ژن 16S rRNA است؛ ولی در برخی مواقع ژن tuf برای تفکیک استرین‌‌های مختلف اکولوژیکی در میان زیرگروههای 16S rRNA مفید بوده است (Langer and Maixner, 2004)؛ برای مثال چندین استرین در بین زیرگروههای 16XII-A و 16XII-B با آنالیز توالی ژن tuf تشخیص داده شده است (Iriti et al., 2008).

طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها براساس ژن پروتئین ریبوزومی

ژن پروتئین ریبوزومی (rplV (rpl22) و rpsC (rps3)) نسبت به ژن‌‌های S rRNA16 متنوع‌‌تر است و ویژگی‌‌های فیلوژنتیکی مفیدی دارد؛ درنتیجه قدرت تمایز در تعیین استرین‌‌های مختلف فایتوپلاسمایی را در گروهها و زیرگروههای مختلف 16S rRNA تقویت می‌‌کند (Martini et al., 2002; Lee et al., 2004). مطالعات اخیر روی تمایز جدایه‌‌های فایتوپلاسمایی در گروههایSrI 16 و SrV 16 نشان می‌‌دهد بررسی ژن پروتئین ریبوزومی نه‌‌تنها به‌‌آسانی برخی زیرگروههای فایتوپلاسمایی متعلق به گروههای Sr 16 را ترسیم می‌‌کند، جدایه‌‌های مختلف در بین یک زیرگروه را نیز از یکدیگر متمایز می‌‌کند (Martini et al., 2002; Lee et al., 2004).

گاهی اعضای زیرگروهها ازنظر ویژگی‌‌های بیولوژیکی و اکولوژیکی از یکدیگر متمایز می‌‌شود؛ برای مثال فایتوپلاسمای عامل سرکپه‌‌ای ذرت (maize bushy stunt (MBS))، عضوی از زیر‌‌گروه SrI-B16 طبقه‌‌بندی شده است؛ در حالی که ازنظر دامنة محدود میزبان گیاهی و ناقلین اختصاصی، از سایر اعضای گروه SrI16 متمایز است و زیرگروه متمایزی را ازنظر پروتئین ریبوزومی نمایش می‌‌دهد؛ به‌‌علاوه زیرگروه SrV-C16 براساس آنالیزهای RFLP با چندین آنزیم برشی کلیدی، به چند زیرگروه براساس پروتئین ریبوزومی تقسیم می‌‌شود (Martini et al., 2002; Lee et al., 2004).

طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها براساس ژن SecY

ژن secY، مارکر مولکولی دیگری برای تمایز ظریف بین جدایه‌‌های فایتوپلاسمایی است. تنوع توالی این ژن در بین جدایه‌‌های فایتوپلاسمایی شبیه به پروتئین ریبوزومی است. میانگین تشابه توالی بین توالی‌‌های ژن secY در دو گروه Sr16 فایتوپلاسمایی بین 4/57 تا 76 درصد متغیر است. زیرگروههای ترسیم‌‌شده براساس آنالیزهای RFLP توالی ژن secY از دو گروه SrI16 و SrV16به‌‌طور معمول شباهت دارد به آنچه برای ژن پروتئین ریبوزومی طراحی شده است (Lee et al., 2004; Martini et al., 2007)؛ با ‌‌این حال قدرت تمایز ژن secY به‌‌وضوح از ژن پروتئین ریبوزومی بهتر است. این ژن نیز مانند ژن پروتئین ریبوزومی گزینة مناسبی برای طبقه‌‌بندی جدایه‌‌های فایتوپلاسمایی در سطح زیرگروه است.

طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها براساس ژن SecA و سایر ژن‌‌ها

ژن کدکنندة پروتئین SecA اخیراً برای طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها استفاده شده است. قسمتی از توالی ژن یادشده که حدود 480 جفت باز است، با استفاده از روش واکنش زنجیره‌‌ای پلی‌‌مراز از فایتوپلاسماهای مختلف متعلق به گروه SrXII16 تکثیر شد. تشابه توالی‌‌ها بین هر دو گروه بین 7/67 تا 4/84 درصد بود. قدرت تفکیک ژن SecA در جایگاه عامل فیلوژنی برای تمایز فایتوپلاسماها شبیه به ‌‌ژن‌‌های پروتئین ریبوزومی و secY است (Shao et al., 2006).

ژن nusA (Shao et al., 2006) و ژن‌‌های فولایت (Folate)، برای مثال ژن‌‌های folP و folk (Davis et al., 2003)، برای تمایز جدایه‌‌های فایتوپلاسمایی گروههای SrI16 و SrXII16 به کار رفته و ثابت شده که این ژن‌‌ها برای تمایز فایتوپلاسماها مفید است. چندین ژن، شامل dnaA (پروتئین آغازگر رونویسی کروموزومی را کد می‌‌کند)، polC (زیرواحد آلفای آنزیم DNA پلی‌‌مراز III را کد می‌‌کند) و dnaE (زیرواحد آلفای ژن DNA پلیمراز III را کد می‌‌کند) در جایگاه ژن‌‌های نامزد برای طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها مطرح است. تنوع توالی این ژن‌‌ها شبیه یا بیشتر از ژن secY است (Shao et al., 2006).

سیستم طبقه‌‌بندی پلی‌‌فازی

مطالعات فیلوژنتیکی با استفاده از سه ژن S rRNA16، ناحیة بین ژنی rRNA S23- S16 و ژن tuf در فایتوپلاسماها، نتایج یکسانی را در بر داشته است (IRPCM, 2004). اگرچه روابط خویشاوندی بین طبقه‌‌بندی فیلوژنی فایتوپلاسماها و طبقه‌‌بندی مبتنی‌‌بر بیماری‌‌زایی و سایر خصوصیات بیولوژیکی فایتوپلاسماها هنوز به‌‌‌‌وضوح مشخص نشده است، به‌‌طور وسیعی در تمایز و طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها استفاده می‌‌شود. ژن S rRNA16 به قدری متنوع نیست که فایتوپلاسماهایی را که ازنظر میزبان و ناقل اختصاصی هستند، از یکدیگر تفکیک کند؛ همچنین ناحیة بین ژنی rRNA S23 و rRNA S16 قطعة کوچکی است که حتی از آن برای آزمایش‌‌های روزمرة تشخیص، طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها و آنالیزهای RFLP استفاده نمی‌‌شود.

سیستم تاکسونومی پلی‌‌فازی براساس خصوصیات فیلوژنتیکی و فنوتیپی در کمیتة بین‌‌المللی سیستماتیک باکتری‌‌شناسی و زیرکمیتۀ تاکسونومی مالیکیوت‌‌ها ارائه شده است (IRPCM, 2004). توافق بر این شده است که توالی کامل ژنوم باکتریایی، اساس فیلوژنی و تاکسونومی ‌‌باشد؛ بر این اساس نام‌‌گذاری باید منطبق بر اطلاعات ژنومی و انعکاس‌‌دهندة آن باشد. به‌‌دلیل دردسترس‌‌نبودن توالی‌‌های کامل ژنومی، تاکسونومی فایتوپلاسماها باید بر ترکیبی از خصوصیات فنوتیپی و فیلوژنی‌‌ تکیه داشته باشد. علاوه‌‌بر ژن‌‌های S rRNA16، از ژن‌‌های پروتئین ریبوزومی rpl22 و rps3 و ناحیة بین rRNA S23 و rRNA S16 نیز برای طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها استفاده شده است که ناحیة بین rRNA S23 و rRNA S16 به‌‌طور چشمگیری از ژن S rRNA16 متنوع‌‌تر است.

تاکسونومی براساس الگوی مجازی RFLP از ناحیةS rDNA 16

به پشتوانة پیشرفت‌‌های تکنولوژیکی اخیر، روش‌‌های جدیدی برای طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها ارائه شده است. درحال حاضر، هزینة تعیین توالی نوکلئوتیدی کاهش پیدا کرده و روش‌‌های بیوانفورماتیک جدید برای تجزیة داده‌‌های نوکلئوتیدی توسعه یافته است. تا سال 2018، توالی نوکلئوتیدی ژن S rRNA16 بیش از18000 فایتوپلاسما در مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی (National Center for Biotechnology Information (NCBI)) قرار داده شده بود.

دردسترس‌‌بودن داده‌‌های مربوط به توالی نوکلئوتیدی قطعه‌‌هایی از ژنوم فایتوپلاسماها با کیفیت زیاد، این امکان را فراهم کرد تا الگوی RFLP مجازی برای شناسایی و طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماهای مختلف تهیه شود. این الگوی مجازی، بررسی‌‌های RFLP را براساس تخمین کامپیوتری انجام می‌‌دهد، منجر به پیدایش گروههای جدید برای فایتوپلاسما شده و به‌‌طور مشخص طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها براساس توالی ژن S rDNA16 را بهبود و توسعه داده است. اندازة قطعات استفاده‌‌شده در این روش، به‌‌طور تقریبی 1250 جفت باز و مربوط به ناحیة تکثیرشده با آغازگرهای عمومی R16F2n/R16R2 (Universal primers) است (Wei et al., 2007).

نرم‌‌افزار iPhyClassifier برای بهبود و توسعة اثر و ظرفیت سیستم طبقه‌‌بندی مجازی فایتوپلاسماها براساس توالی ژن S rDNA16 تهیه شده است. این ابزار، آنالیزهای تشابه توالی را انجام می‌‌دهد، هضم آنزیمی آن را تخمین می‌‌زند و به دنبال آن الگوی قطعات حاصل از هضم آنزیمی (RFLP) را تهیه می‌‌کند. نرم‌‌افزار iPhyClassifier براساس محاسبة ضریب تشابه الگوی RFLP (RFLP pattern similarity coefficients) و نمرة تشابه توالی (Sequence similarity scores)، موقعیت تاکسونومیک گروه و زیرگروه تجربی S rDNA16 فایتوپلاسما را فوری پیشنهاد می‌‌کند و گونة پیشنهادی فایتوپلاسما (Candidatus Phytoplasma) تعیین می‌‌شود. از آنجایی که این ابزار تنها براساس اطلاعات توالی کار می‌‌کند، هر خطایی در توالی منجر به تشخیص اشتباه گروه یا زیرگروه مربوطه خواهد شد. این خطا ممکن است در حین انجام واکنش PCR، همسانه‌‌سازی در وکتور یا تعیین توالی قطعۀ همسانه‌‌سازی‌‌شده اتفاق بیفتد. برای تکرارپذیری و اطمینان از عملکرد این ابزار توصیه می‌‌شود حداقل، توالی قطعۀ تکثیرشده از دو نمونۀ مجزا (گیاه یا زنجرک) بررسی شود. اگر تنها یک نمونۀ آلوده دردسترس است، باید حداقل دو قطعۀ S rDNA16 همسانه‌‌سازی‌‌شدۀ حاصل از دو واکنش PCR مجزا بررسی شود. این ابزار به‌‌صورت اینترنتی ازطریق آدرس http://www.ba.ars.usda.gov/data/mppl/iPhyClassifier.html دردسترس است (شکل 1) (Zhao et al., 2009).

جدول 2- طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها براساس آنالیز RFLP ژن 16S rDNA (Zhao and Davis, 2016)

شکل 1- تصویر صفحۀ اول iPhyClassifier در شبکۀ اینترنت

طبقه‌‌بندی براساس RFLP مجازی ژن cpn60

ژن هدف عمومی cpn60، یک قطعۀ به‌‌طور تقریبی 550 جفت بازی است که به‌‌طور گسترده‌‌ای در مطالعۀ جمعیت‌‌های میکروبی استفاده می‌‌شود (Town et al., 2014) و درجایگاه بارکد مولکولی برای دامنۀ باکتری‌‌ها پیشنهاد شده است. اگرچه همة مالیکیوت‌‌ها این ژن را در ژنوم خود ندارند، این ژن در ژنوم همة فایتوپلاسماهای تعیین توالی‌‌شده و همۀ جدایه‌‌های تاکنون گزارش‌‌شده وجود دارد (Bai et al., 2006; Andersen et al., 2006; Kube et al., 2008; Tran-Nguyen et al., 2008; Oshima et al., 2013)؛ با این حال به نظر می‌‌رسد جدایه‌‌های متعلق به گروه سه (16SrIII) فاقد این ژن باشند که استفاده از این تکنیک را برای طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها محدود می‌‌کند؛ با این وجود روش‌‌های پیشرفتة امروزی برای استفاده از توالی cpn60 UT فایتوپلاسماها، این امکان را برای طبقه‌‌بندی از این ژن در طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماها به گروهها و زیرگروههای اصلی فراهم آورده است. براساس RFLP مجازی قطعات تعیین توالی ژن cpn60 UT، 14 گروه اصلی و 25 گروه فرعی به شرح جدول زیر برای طبقه‌‌بندی جدایه‌‌های مختلف فایتوپلاسمایی تعیین شده است (شکل 2) (Perez-Lópeze et al., 2016).

شکل 2- تفکیک گروههای مختلف فایتوپلاسمایی و طبقه‌‌بندی با برش ژن 16S rDNA توسط آنزیم‌‌های MseI، RsaI و HinfI (Wei et al., 2007).

بعد از تعیین توالی ژن هدف cpn60 UT به‌‌منظور تعیین گروه و زیرگروه مربوط، آنالیزهای RFLP مجازی انجام خواهد شد. نمونه‌‌ای از این آنالیزها برای تفکیک جدایه‌‌های گروه یک در شکل 3 نشان داده شده است (Perez-Lópeze et al., 2016).

شکل 3- آنزیم‌‌های کلیدی برای تفکیک جدایه‌‌های مختلف فایتوپلاسمایی به زیرگروهها در گروه یک براساس ژن cpn60 UT (اندازة مارکر لدر یک کیلو باز ژن آزمایشگاهی (اینویتروژن) است.)

جدول 3- تعداد باندهای حاصل از RFLP توالی cpn60 UT در جدایه‌‌های رفرنس در گروههای مختلف فایتوپلاسمایی

نام‌‌گذاری فایتوپلاسماها

نام‌‌گذاری فایتوپلاسماها و بیماری‌‌های ناشی از آنها نظم خاصی ندارد. بیماری‌‌های فایتوپلاسمایی قبل از مشاهده یا شناسایی عامل آنها، نام‌‌گذاری می‌‌شوند. نام فایتوپلاسمای عامل بیماری، در بیشتر مواقع، شبیه نام بیماری‌‌ است که ایجاد می‌‌کند و آن نیز به‌‌طور معمول براساس نوع علائمی است که در اثر آن بیماری در گیاه بروز کرده است. این روش در بسیاری از مواقع گیج‌‌کننده و مشکل‌‌زا ‌‌است؛ زیرا خصوصیات بیولوژیک به‌‌تنهایی برای شناسایی مناسب نیست. گاهی یک فایتوپلاسما ممکن است عامل چند بیماری مختلف روی گیاهان گوناگون باشد و علائم مختلفی در میزبان‌‌های متفاوت ایجاد کند؛ همین‌‌طور ممکن است فایتوپلاسماهای گوناگون علائم مشابهی را در یک یا چند میزبان مختلف ایجاد کنند (Firrao et al., 2007; Schweigkofler, 2008)؛ بنابراین نام‌‌گذاری فایتوپلاسماها موقتی و دائم درحال تغییر است. پژوهشگران زمان و فعالیت بسیاری را برای نیل به سیستم صحیح نام‌‌گذاری فایتوپلاسماها و بیماری‌‌های ناشی از آنها لازم می‌‌دانند (Welliver, 1999; Bertaccini et al., 2014). موری و شلیفر (1994) پیشنهاد کردند واژة «Candidatus» قبل از نام علمی عوامل بیماری‌‌زای کشت‌‌نشدنی درج شود. این ‌‌امر ضمن حل موقت و علمی موضوع، شرایط ثبت مناسب تاکسون‌‌های بالقوه‌‌ای را فراهم کرد که برمبنای تعیین توالی نوکلئوتیدی بخشی از ژنوم آنها، شناسایی شده‌‌اند (Firrao et al., 2007; Lee et al., 1998).

نام‌‌گذاری جدایه‌‌های کشت‌‌نشدنی پروکاریوت‌‌ها به‌‌صورت «Candidatus» برمبنای داده‌‌های نوکلئوتیدی DNA، زیستگاه آنها و داده‌‌های متابولیکی است. در فایتوپلاسماها زیستگاه، همان میزبان محسوب می‌‌شود. هرچند فایتوپلاسماها در بدن حشرة ناقل خود نیز تکثیر می‌‌شوند و زندگی می‌‌کنند، فرض بر این است که آنها در میزبان گیاهی خود تکامل یافته‌‌اند ((Firrao et al., 2007؛ همچنین برمبنای پیشنهاد موری و شلیفر (1994) در توصیف گونه به‌‌‌‌صورت «Candidatus، باید توالی یک قطعه از توالی ژن srRNA 16 (بیش از 1200 جفت باز) آن گونه کمتر از 5/97 درصد شباهت داشته باشد با هر «Ca» که ازقبل توصیف شده است و توالی این ناحیه در بانک‌‌های اطلاعاتی عمومی ثبت شود تا در صورت لزوم درجایگاه مرجع از آن استفاده شود؛ همچنین باید فهرست توالی‌‌های الیگونوکلئوتیدی شاخص و منحصر به ‌‌فرد آن گونه ارائه شود. برمبنای پژوهش‌‌های زیادی که طی سال‌‌های اخیر انجام شده، مشخص شده است که بعضی جدایه‌‌ها به‌‌طور کامل به هم نزدیک و خویشاوند هستند؛ حتی اگر توالی S rDNA16 آنها کمتر از 5/97 درصد شبیه به هم نباشد (Firrao et al., 2007). به‌‌دلیل ماهیت بسیار حفاظت‌‌شدۀ ژن S rDNA16، بسیاری سویه‌‌های فایتوپلاسما ممکن است ازنظر بیولوژیکی یا اکولوژیکی متمایز باشند؛ ولی توالی S rDNA16 آنها کمتر از 5/97 درصد شبیه به هم نباشد و نیاز به نام‌‌گذاری جدید داشته باشند؛ پس به این منظور از ویژگی‌‌های بیولوژیکی منحصر به فرد دیگر مانند واکنش به آنتی‌‌بادی اختصاصی، دامنۀ میزبانی و ناقل اختصاصی و همچنین سایر معیارهای مولکولی (ژن‌‌ها) استفاده می‌‌شود (Seemüller and Schneider, 2004).

جمع‌‌بندی

فایتوپلاسماها، پروکاریوت‌‌های بدون دیوارة سلولی هستند و تنها در بافت زندة میزبان‌‌های گیاهی و جانوری خود رشد می‌‌کنند. بیمارگرهای گیاهی شبه‌‌مایکوپلاسما، به‌‌دلیل نداشتن دیوارة سلولی، در ردة مالیکیوت‌‌ها منظور شده‌‌اند. این بیمارگرها برای ادامة حیات و تأمین بسیاری از مواد لازم خود، با میزبان‌‌های گیاهی و جانوری سازگار شده‌‌اند. نام فایتوپلاسمای عامل بیماری در بیشتر مواقع شبیه نام بیماری است که ایجاد می‌‌کند و آن هم به‌‌طور معمول براساس نوع علائمی است که در اثر آن بیماری در گیاه بروز کرده است. در دهة گذشته روش‌‌هایی برپایة بیولوژی و ژنتیک مولکولی، مانند مقایسة توالی نوکلئوتیدی بخشی از RNA ریبوزومی، این امکان را فراهم آورده است که نخست، ارتباط بین علائم بیماری و عامل یا عوامل بیماری به‌‌طور دقیق‌‌تری تعیین شود و دوم، روابط تکاملی و فیلوژنتیکی بین جدایه‌‌های مختلف فایتوپلاسماها با یکدیگر و با سایر پروکاریوت‌‌ها واقع‌‌بینانه‌‌تر مشخص شود. تلاش‌‌هایی برای تشخیص و طبقه‌‌بندی فایتوپلاسماهای ناشناخته براساس ژن S rRNA16 یا ناحیة بین ژنی S16 و S23 انجام شده است. این روش هنوز برای آنالیز تعداد زیادی از فایتوپلاسماهای ناشناخته (در مقیاس وسیع) کاربردی است. گروه‌‌بندی دقیق‌‌تر زیرخوشه‌‌ها با استفاده از مناطق کمتر محافظت‌‌شده، مانند ژن کدکنندة پروتئین ریبوزومی و ناحیة بین ژن‌‌های S16 و S23، ژن هدف عمومیcpn60، ژن کدکنندة پروتئین SecA، ژن secY، ژن پروتئین ریبوزومی (rp) و ژن tuf انجام می‌‌گیرد.