نویسندگان
1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران
2 مربی، گروه زیست‌شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران 4697 – 19395، ج. ا. ایران
چکیده
کلیدواژه‌ها
موضوعات
عنوان مقاله [English]
نویسندگان [English]
Trifolium resupinatum and T. fragiferum are two important crop species among the legumes. T. fragiferum is considered as one of the gene pools of T. resupinatum. In this study, the transferability of SSR markers from T. pratense and T. repens to genotypes of these two species was evaluated and new microsatellite loci for these species were obtained. Their genomic similarity was studied using the SSR markers and phenetic analysis. The results of this study indicated a high level of transferability and polymorphism for microsatellites from T. pratense and T. repens to genotype of T. resupinatum and T. fragiferum. Studies also showed that the genetic diversity was high among the populations and the studied populations were grouped in the low levels of similarity. Also, T. resupinatum and T. fragiferum were grouped in clusters with very low similarity that indicated genomic differences between them in tested SSR loci. This study showed that microsatellites can be useful tools to evaluate genetic variation in these species. The results suggested that as long as specific SSR primers for these two species were not designed, SSR primers of T. pratense and T. repens could be used with high reliability for genomic analysis of these species.
کلیدواژه‌ها [English]
مقدمه
جنس شبدر (Trifolium L.) متعلق به طایفه Trifolieae Brongniart از تیره باقلائیان (Fabaceae Lindley) یکی از مهم‌ترین جنس‌های گیاهی از نظر زراعی و تعداد گونه (255 گونه در جهان) است (Ellison et al.,2006). این جنس خویشاوندی بسیار نزدیکی با جنس‌های Trigonella L.، Medicago L. و Melilotus Miller دارد. بدون شک، ناحیه مدیترانه‌ای مرکز کشت و به‌نژادی بیشترین گونه‌های زراعی جنس شبدر است (Zohary and Heller, 1984). گونه‌های مختلف جنس شبدر علاوه بر استفاده به صورت علوفه، به طور وسیع در زنبورداری و به ندرت به عنوان سبزیجات خوراکی و دارویی استفاده می‌شوند (Zohary and Heller, 1984). شبدر پس از یونجه (Medicago) مهم‌ترین گیاه علوفه‌ای دو لپه‌ای است که با سطح کشت حدود یکصد هزار هکتار جایگاه ویژه‌ای در کشور دارد (زمانیان، 1384) و باعث افزایش شدید نیتروژن خاک شده، مبنای تناوب کشت را تشکیل می‌دهد (جود و همکاران، 1382). مهم‌ترین گونه‌های زراعی جنس Trifolium در ایالات متحده که بیشترین کشت و زراعت شبدر را در جهان دارد گونه‌های T. pretense L.(شبدر قرمز)، T. repens L. (شبدر سفید)،
T. incarnatum L. (شبدر لاکی) و T. hybridum L. (شبدر دو رگ) هستند (Taylor, 1985)، در حالی که در ایران مهم‌ترین گونه زراعی کشور با سطح زیر کشت حدود 100 هزار هکتار Trifolium resupinatum L. (شبدر ایرانی) است (عباسی و زمانیان، 1384). شبدر ایرانی، گیاهی یک‌ساله با دو فصل رویش بهار و زمستان است. گونه T. Clusii Godr. & Gren. خزانه ژنی دوم و گونه T. fragiferum L. (شبدر توت‌فرنگی) خزانه ژنی سوم این گونه هستند (Taylor and Gillett, 1988). زمانی که به‌نژادگران نتوانند آلل‌های موردنظرشان را از خزانه ژنی اول (تمام ارقام و کولتیوارهای اصلاح شده جمعیت‌های بومی و جمعیت‌های خودرو در هر گونه زراعی) به دست آورند، خزانه‌های ژنی دوم و سوم را جستجو می‌نمایند (Fehr, 1987). شبدر توت‌فرنگی،گیاهی چندساله با عادت رشد به طور عمده خوابیده و دارای ساقه‌های رونده (stolon) است که علاوه بر تکثیر جنسی به وسیله بذر با قطعه قطعه شدن ساقه به طریق رویشی، قابلیت تکثیر دارد. با اینکه این گونه پتانسیل استفاده در سیستم‌های مرتع و چراگاهی را دارد، اما هنوز در کشور به عنوان گونه زراعی مورد استفاده قرار نگرفته است. این گونه به دلیل ساقه‌زایی بالا، فقدان کُرک در بیشتر جمعیت‌ها، نرمی بافت رویشی، تولید بیوماس بالا و سازگاری با خاک‌های شور و قلیایی (Taylor and Gillett, 1988) می‌تواند یکـی از مناسب‌ترین گونه‌ها در مـراتع و چـراگاه‌های پایا باشد. همچنین، در صورت نیاز به‌نژادگران در برنامه‌های دو رگ‌گیری با شبدر ایرانی استفاده شود (عباسی، 1387). دامنه پراکنش جغرافیایی T. fragiferum،اروپا، قبرس، ترکیه، ایران، قفقاز و سوریه است و در نواحی شمال، شمال‌غرب، غرب و مرکز ایران می‌روید، در حالی که
T. resupinatum در نواحی بالکان، آسیای میانه، ترکیه، ایران، روسیه، عراق، سوریه، فلسطین و مصرگسترش یافته، در بخش‌های شمال، غرب، جنوب‌غرب و مرکز ایران پراکنده است (Heller, 1984).
ریزماهواره‌ها یا نشانگرهای مولکولی SSR شامل توالی‌های تکراری ساده با واحدهای 1 تا 6 نوکلئوتیدی هستند که به دلیل مزایای زیادی که نسبت به سایر نشانگرهای مولکولی دارند بیشتر مورد توجه قرار گرفته‌اند. از جمله مزایای آنها می‌توان به کاربرد آسان، سادگی تفسیر نتایج، میزان بالای تنوع، فراوانی و تنوع زیاد آلل‌ها در سطح ژنوم یوکاریوت‌ها، الگوی توارث هم‌بارز و تکرارپذیر بودن نتایج اشاره کرد. این مزایا سبب شده تا این نشانگر مولکولی به طور وسیع در تهیه نقشه‌های ژنتیکی، تخمین تنوع ژنتیکی، مطالعه روابط خویشاوندی و همچنین در برنامه‌های به‌نژادی در گیاهان مورد استفاده قرار گیرد. از جمله معایب این نشانگر پیچیدگی و صرف هزینه و وقت زیاد را می‌توان نام برد (نقوی و همکاران، 1384). در جنس شبدر، از این نشانگرها تنها در آنالیز ژنوم گونه‌های T. pratense و T. repens استفاده شده است Sato et al.,2005)؛ Dias et al., 2008؛ Zhang et al.,2007؛ Zhang, 2010). Sato و همکاران (2005) و Zhang و همکاران (2007) با استفاده از نشانگرهای SSR به ترتیب نقشه ژنتیکی T. pratense و T. repens را تهیه نمودند. همچنین، تنوع ژنتیکی در T. pratense با استفاده از صفات ریخت‌شناختی و نشانگرهای SSR (Dias et al., 2008) و در T. repens بر پایه صفات ریخت‌شناختی، نشانگرهای SSR وRAPD (Zhang, 2010) ارزیابی شده است. بررسی منابع نشان می‌دهد که تاکنون تحقیقاتی در زمینه جداسازی، شناسایی و تعیین ردیف بازی توالی‌های تکراری ساده گونه‌های
T. resupinatumو T. fragiferumانجام نشده است. به منظور رفع کمبود اطلاعات موجود در این زمینه می‌توان اقدام به جداسازی و توالی‌یابی این جایگاه‌های ژنی کرد و یا نسبت به بررسی انتقال‌پذیری آغازگرهای توالی‌های تکراری ساده (SSR) به دست آمده از گونه‌های خویشاوند در این گونه‌ها پرداخت. در این پژوهش، با توجه به کم هزینه‌تر بودن، سادگی و سرعت روش اخیر و همچنین تعدد مکان‌های توالی‌های تکراری ساده شناخته شده در دو گونه T. pratense و T. repens، انتقال‌پذیری آغازگرهای این دو گونه به ژنوتیپ‌های T. resupinatum و T. fragiferum به منظور بررسی میزان شباهت ژنتیکی این دوگونه ارزیابی شد و ریزماهواره‌های تکثیر شده به عنوان ریزماهواره‌های جدید در گونه‌های T. resupinatum و T. fragiferumمعرفی گردید.
مواد و روش‌ها
در این تحقیق، 19 جمعیت خودرو شامل 8 جمعیت از T. fragiferum و 11 جمعیت از T. resupinatum ارزیابی شد. نمونه‌های جمعیتی به گونه‌ای انتخاب شد که تمامی دامنه پراکنش این گونه‌ها در ایران را پوشش دهد. مشخصات مربوط به این جمعیت‌ها در جدول 1 نشان داده شده است. نمونه‌ها در فصول رویشی سال‌های 1388 و 1389 به صورت بذر و نمونه هرباریومی توسط مؤلف جمع‌آوری و نمونه‌های سند به هرباریوم دانشگاه اصفهان (HUI) سپرده شد. نمونه‌ها بر اساس کلید ارائه شده در فلورا ایرانیکا (Heller, 1984) شناسایی شدند. بذرها در شرایط گلخانه‌ای کشت و DNA ژنومی از برگ‌های تازه و جوان استخراج گردید. استخراج DNA از این جمعیت‌ها با روش CTAB تغییر یافته (Lefort and Douglas, 1999) انجام گرفت.
غلظت DNA استخراج شده، توسط الکتروفورز افقی، مشاهده بر روی ژل آگاروز 8/0 درصد و مقایسه با الگوی نشانگر مولکولی Lambda III (λ3) با وزن مولکولی مشخص به عنوان شاهد ارزیابی شد.
در این تحقیق، 22 جفت از آغازگرهای مشترک بین T. pratense و T. repens که با احتمال بیشتری قادر به تکثیر ریزماهواره‌ها و بیان تنوع ژنتیکی جمعیت‌های T. resupinatum و T. fragiferum هستند، انتخاب شدند (جدول 2). انتخاب این آغازگرها بر اساس اشتراک بین دو گونه T. pratense و
T. repens، چندشکلی و فراوانی آللی بالا صورت گرفت.
جدول 1- مشخصات نمونه‌های جمعیتی مطالعه شده از گونه‌های T. fragiferumو T. resupinatum. HUI = هرباریوم دانشگاه اصفهان
|
تاکسون |
کد |
شماره |
تاریخ |
ارتفاع |
محل جمع‌آوری |
|
T. fragiferum var. fragiferum |
Tff1 |
17836 HUI |
31/04/1389 |
2108 |
تهران: فیروزکوه به پلور، ارجمند |
|
Tff2 |
17835 HUI |
29/05/1388 |
0 |
گلستان : گلوگاه به گرگان، روستای النگ |
|
|
Tff3 |
17838 HUI |
14/05/1388 |
1250 |
آذربایجان غربی: 20 کیلومتری اهر به مشکین شهر، روستای نقاره کوب |
|
|
Tff 4 |
17847 HUI |
01/05/1388 |
1929 |
لرستان: شول آباد |
|
|
T. fragiferum var. pulchellum |
Tfp1 |
17830 HUI |
14/05/1388 |
1250 |
آذربایجان غربی: 20 کیلومتری اهر به مشکین شهر، روستای نقاره کوب |
|
Tfp2 |
17833 HUI |
29/04/1389 |
0 |
مازندران: بهمنیر به قائم شهر |
|
|
Tfp3 |
17834 HUI |
12/05/1388 |
1300 |
کردستان: 60 کیلومتری پیرانشهر از سردشت، نرسیده به موسالان |
|
|
Tfp4 |
17839 HUI |
14/05/1388 |
1770 |
آذربایجان غربی: دامنه سبلان، 8 کیلومتری آبگرم قینرجه و موئیل |
|
|
T. resupinatum var. resupinatum |
Trr1 |
17895 HUI |
25/02/1388 |
110 |
خوزستان: 5 کیلومتری جاده اندیمشک به شوش |
|
Trr2 |
17897 HUI |
08/03/1388 |
1303 |
گلستان: علی آباد، سه راه کبودوال |
|
|
Trr3 |
17901 HUI |
21/03/1389 |
79 |
گیلان: 17 کیلومتری رشت از قزوین- روستای جوکلبندان |
|
|
T. resupinatum var. microcephalum |
Trmi1 |
17893 HUI |
25/02/1388 |
94 |
خوزستان: 20 کیلومتری جاده اندیمشک به شوش |
|
Trmi2 |
17892 HUI |
11/03/1388 |
330 |
مازندران: زیرآب به فیروزکوه، 4 کیلومتری زیرآب |
|
|
Trmi3 |
17894 HUI |
25/03/1389 |
43 |
گیلان: رضوانشهر |
|
|
T. resupinatum var. majus |
Trma5 |
17903 HUI |
27/02/1388 |
828 |
خوزستان: کیلومتر 5 جاده ایذه به دهدز |
|
Trma1 |
17887 HUI |
08/03/1388 |
200 |
گلستان: علی آباد به آزادشهر، ابتدای جاده زرین گل |
|
|
Trma2 |
17890 HUI |
02/05/1388 |
1488 |
لرستان: درود |
|
|
Trma3 |
17886 HUI |
25/02/1388 |
879 |
لرستان: بعد از پل دختر- بین تنگ فنی و روستای ولیعصر |
|
|
Trma4 |
17883 HUI |
27/01/1389 |
424 |
خوزستان: باغ ملک به رامهرمز، بعد از رود زرد |
به منظور بهینه‌‌سازی، یعنی تعیین غلظت‌‌های مناسب مواد واکنش و دمای مناسب اتصال آغازگرها (Ta, annealing temperature) جهت به دست آوردن محصول PCR مناسب، غلظت اجزای واکنش PCR (یون منیزیم، غلظتDNA و آغازگرها) و نیز دمای اتصال در شرایط مختلف برای هر یک از آغازگرها جداگانه توسط PCR گرادیان تعیین شد و سپس با بررسی محصول PCR بهترین غلظت و مناسب‌ترین دما انتخاب گردید. محدوده گرادیان دمایی حداکثر بین 8± درجه سانتیگراد پایین‌ترین دمای ذوب توصیه شده برای هر زوج آغازگر در نظر گرفته شد. برای هر زوج آغازگر یک محدوده دمایی بهینه از حداقل تا حداکثر دمای بهینه تعیین گردید (شکل 1(، به طوری که دربردارنده دمای بهینه اتصال برای هر دو گونه باشد. بنابراین، فرآیند PCR برای هر دو گونه به طور هم‌زمان انجام شد. از 22 زوج آغازگر SSR استفاده شده، 13 زوج از آنها دارای محصول PCR مشخص و منفرد نبودند و یا نتوانستند قطعات DNA را تکثیر کنند. به همین دلیل نشدند (جدول 2). 9 زوج آغازگر که در PCR گرادیان دارای محصول PCR مشخص بودند انتخاب و فرآیند PCR پس از تعیین دمای مناسب برای آنها انجام شد.
شکل 1- تعیین دمای بهینه اتصال زوج آغازگر RCS-1225 بر روی ژنوم T. fragiferum و T. resupinatum
جدول 2- توالی 22 زوج آغازگر نشانگرهای SSR آزموده شده در 19 جمعیت از گونه‌های T. fragiferumو T. resupinatum. * آغازگرهایی که توانستند در این مطالعه ریزماهواره‌های مورد نظر را تکثیر کنند.
|
نام آغازگر |
ردیف قطعه تکراری |
توالی آغازگر پیرو (′3 → ′5) |
توالی آغازگر پیشرو (′3 → ′5) |
|
RCS0883 * |
AAG |
GAAGAGATAGCTTGCCTTGGA |
CACGTTACTCAATTTGGATCTTTG |
|
RCS0907 |
AAC |
TGGGGAAGTGAAGGATGTTC |
ATTTGAGCACAAGGCCTCAC |
|
RCS1479 |
AG |
ATCAACTCGATGGGAACACC |
TTTTCTGGCGACGAATTAGG |
|
RCS2773 |
AAG |
GATTTCGATCCTCCTCCTCC |
AATAACAATATGCGGCTTTGC |
|
RCS0033 |
AAT |
GCAGATTATGAGGAATAACATTG |
AAATTATCATTTTGCAAATTTTA |
|
RCS2343 |
AC |
TTCAATCGGGAGTGTCAGTG |
CGATTGCTACAAACACAGCC |
|
RCS1735 * |
AAC |
GGTGCTAGCTCCAACCTCAG |
CCTGCTCCGTACCATTGTTT |
|
RCS2667 * |
AAG |
GGTGGTGTTGCTGATTACGA |
CCTCAGCAGAATCTTCACCC |
|
RCS1920* |
AAG |
CCCCCAAAATACAAAACCCT |
GAGAAAAGAAAGAAGTCTCTGAAGGA |
|
RCS1928 * |
AGC |
CCTTTCAGAACAGATGGCGT |
TACCCTCTTGAGCACCCATT |
|
RCS2202 * |
AC |
CGGCAGACGAAGTGACAAAT |
GCCGATATTGCTAGGTTGGA |
|
RCS1225 * |
ATC |
CTCGCTGAAGGAGGAAACAG |
TGCAAACTCCGCTTTATGC |
|
RCS1737 |
ATC |
AGCTCAAGCTCAACGGACAT |
GGCACGAGGCACACTACTTC |
|
RCS1518 |
ATC |
CGAAGCAGGTTGGAAAACAT |
GCACGAGGCACACACTACTT |
|
RCS0843 |
GGAT |
TTGGCATCTCAAAGCTGAAA |
GCCAAGCCCACCAATACATA |
|
RCS3666 * |
AC |
TCTGTTTCTTGTCTCGGCCT |
CATGGCTGCCTGAGGTTAAT |
|
RCS3052 |
AAC |
CACTAATTCAGACCACCAGCA |
TCGGTGAGCTGTGACTAACG |
|
RCS1327 |
ATC |
AAACAAACCAAGCAGCACCT |
ACGGTGGAATTATGGGATGA |
|
RCS0793 |
AAG |
TTCAACATGCAGGCTAAGAAAA |
CGCAATCTTTCTTCTCATTTCA |
|
RCS1897 * |
AAAG |
ATGAGCACCTTCACCAATCC |
CATGTCAGCATATCCATTTTCC |
|
TRSSRATS054 |
------- |
AATCACGACGAGCGACAACA |
GACACCGATTATGTGCAAGA |
|
TRSSRATS055 |
------- |
TCTCTGCTTCGCGTCTTCTC |
CAATACAATCACCGCACCAG |
به طور خلاصه، واکنش PCR در حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 250 نانومول از هر آغازگر، مخلوط dNTP با غلظت 2/0 میلی‌مولار، کلرید منیزیم با غلظت 5/1 میلی‌مولار، 2/1 واحد آنزیمTaq polymerase و 50 تا 100 نانوگرم DNA ژنومی از نمونه‌های مطالعه شده، انجام شد. برنامه PCR به این ترتیب بود: 94 درجه سانتیگراد 4 دقیقه؛ 20 دور با 94 سانتیگراد 1 دقیقه، 1 دقیقه در حداکثر دمای اتصال بهینه، 72 درجه سانتیگراد 1 دقیقه؛ 15 دور با 94 سانتیگراد 1 دقیقه، 1 دقیقه در حداقل دمای اتصال بهینه، 72 سانتیگراد 1 دقیقه؛ در پایان، 10 دقیقه در دمای 72 درجه.
تفکیک باندهای حاصل ابتدا روی ژل آگاروز 2 درصد حاوی اتیدیوم بروماید با ولتاژ 100 ولت انجام شد و تهیه عکس با استفاده از دستگاه UV transiluminator صورت گرفت. برای تفکیک دقیق‌تر باندها از روش الکتروفورز عمودی با ژل پلی‌آکریل‌آمید 12 درصد استفاده شد. رنگ‌آمیزی ژل پلی‌آکریل‌آمید با نیترات نقره و ظهور باندها به وسیله هیدروکسید سدیم انجام شد.
تحلیل باندها با در نظر گرفتن هر شماره باند به عنوان یک صفت انجام گرفت. در ارزیابی تاکسونومی عددی هر باند با دو حالت وجود (1)/غیاب (0) ارزیابی شد. دندروگرام با استفاده از ضریب Dice، Jaccard (J) و Simple Matching (SM) ترسیم شد. به منظور سنجش میزان انطباق دندروگرام رسم شده با ماتریس تشابه، میزان همبستگی کوفنتیک برای هر کدام از ضرایب فوق، محاسبه شد. دندروگرام رسم شده با نرم‌افزار NTSYSpc 2 بر اساس ضریب جاکارد، بیشترین میزان همبستگی (73/0= r) را نشان داد. بنابراین، از این ضریب برای رسم دندروگرام به روش UPGMA استفاده شد. البته تفاوت‌های معنی‌داری در گروه‌بندی‌ها در دندروگرام‌های حاصل از این ضرایب مشاهده نشد. رسته‌بندی توده‌ها نیز با استفاده از تجزیه به مؤلفه‌های اول و دوم (PCA, Principle Coordinate Analysis) به وسیله نرم‌افزار GenAlex6 انجام شد.
بحث و نتیجه‌گیری
از میان 22 جفت آغازگر مورد آزمایش، 9 جفت توانستند 46 آلل در جمعیت‌های گونه T. fragiferumو 56 آلل درجمعیت‌های گونه T. resupinatum تکثیر کنند (جدول 3) که بسیاری از این آلل‌ها بین دو گونه مشترک هستند. این نتیجه می‌تواند بیانگر شباهت زیاد ژنوم این دو گونه باشد.
از میان این آغازگرها، زوج آغازگر RCS1928 که قطعاتی از DNA گونه‌های T. fragiferum و
T. resupinatumرا تکثیر نمود، چه در درون‌گونه‌ها و چه در بین دو گونه، تنوعی نشان نداد (شکل‌های2 و 3) که نشان می‌دهد این ریزماهواره در بخش‌هایی از ژنوم واقع شده است که در طول تکامل، توالی‌های خود را به شدت حفظ نموده است. زوج آغازگر RCS3666 در درون هر دو گونه تنوعی نشان نداد، ولی در بین دو گونه قطعات متفاوتی را تکثیر کرد که گویای وجود تفاوت ژنومی در این ناحیه از DNA دو گونه است (شکل‌های 2 و 3). زوج آغازگرهای RCS1920 و RCS1897 با این که در گونه T. fragiferumتنوعینشان ندادند (شکل 2)، ولی در گونه T. resupinatumبه خوبی چندشکلی را آشکار ساختند (شکل 3). بنابراین، می‌توان چنین نتیجه گرفت که نقاطی از ژنوم که دربردارنده این ریزماهواره‌هاست در گونه
T. fragiferum در نواحی حفاظت شده واقع شده، در حالی که در گونه T. resupinatum در مسیر تکامل دستخوش تغییراتی شده است. به بیان دیگر، این ریزماهواره‌ها در بخش‌هایی از DNA واقع شده‌اند که در بین دو گونه از حیث ساختار و عملکرد متفاوت هستند. زوج آغازگر RCS2667 در گونه
T. fragiferumتنوعی نشان نداد، اما یکی از جمعیت‌های این گونه (Tff4)، دو آللی را که این آغازگر تنها برای گونهT. resupinatumتکثیرکرده بود، نشان داد که می‌تواند بیانگر ردپایی از نفوذ گذشته باشد (شکل 2، باندهای مربوط روی تصویر با پیکان نشان داده شده است).
جدول 3- مقایسه نتایج حاصل از تکثیر 9 نشانگر SSR در 19 جمعیت از گونه‌های T. fragiferumو T. resupinatum
|
ردیف |
نام آغازگر |
محدوده دمای اتصال بهینه |
شبدر توت‌فرنگی (T. fragiferum) |
شبدر ایرانی (T. resupinatum) |
||
|
اندازه قطعات |
تعدادآلل‌ها |
اندازه قطعات |
تعدادآلل‌ها |
|||
|
1 |
RCS0883 |
55-47 |
230 - 150 |
11 |
230 - 150 |
12 |
|
2 |
RCS1225 |
52-48 |
250 - 190 |
5 |
250 - 190 |
5 |
|
3 |
RCS1735 |
52-46 |
310 - 180 |
11 |
310 - 180 |
8 |
|
4 |
RCS1920 |
52-46 |
310 - 220 |
4 |
360 - 220 |
11 |
|
5 |
RCS1928 |
58-50 |
250 - 205 |
4 |
250 - 205 |
4 |
|
6 |
RCS2667 |
52-48 |
200 - 190 |
3 |
200 - 190 |
4 |
|
7 |
RCS3666 |
52-48 |
230 - 200 |
2 |
190 |
1 |
|
8 |
RCS2202 |
51-48 |
120 - 90 |
4 |
120 - 90 |
5 |
|
9 |
RCS1897 |
52-48 |
260 - 240 |
2 |
295 - 240 |
6 |
|
|
|
|
|
46 = |
|
56 = |
شکل 2- الگوی چندشکلی حاصل از تکثیر 9 نشانگر SSR در 8 جمعیت از گونه T. fragiferum
شکل 3- الگوی چندشکلی حاصل از تکثیر 9 نشانگر SSR در 11 جمعیت از گونه T. resupinatum
سایر آغازگرها در هر دو گونه تنوع در خور ملاحظه‌ای نشان دادند. همان طور که دردندروگرام حاصل از تحلیل باندها (شکل 4) مشاهده می‌شود، در بیشتر موارد، میزان شباهت بین جمعیت‌ها اندک است. با توجه به سیستم زادآوری در این دو گونه که اغلب از نوع خودلقاحی (autogamy) است (Taylor and Gillett, 1988)، انتظار می‌رود که کم بودن جریان ژنی بین جمعیت‌ها سبب افزایش تنوع ژنتیکی بین جمعیت‌ها و به همان نسبت کاهش تنوع در درون جمعیت‌ها شود که دندروگرام حاصل از این تحقیق به روشنی این مطلب را نشان داد.
در دندروگرام حاصل از نشانگرهای SSR، دو گونهT. fragiferumوT. resupinatum در سطح 43 درصد کاملاً از هم جدا شدند و جمعیت‌های مربوط به هر گونه بر روی یک خوشه مجزا قرار گرفتند (شکل 4) که این گروه‌بندی با طبقه‌بندی تاکسونومیک این گونه‌ها مطابقت دارد (Zohary and Heller, 1984).
همان طور که دندروگرام (شکل 4) نشان می‌دهد، گونه T. fragiferumاز نظر جغرافیایی دو گروه همپوشان را تشکیل داد: خزانه ژنی شمال-شمال‌غرب و خزانه ژنی غرب-شمال‌غرب، که این دو خزانه ژنی در ناحیه شمال‌غرب همپوشانی دارند. به نظر می‌رسد که این گونه از شمال‌غرب ایران و به احتمال زیاد از کشور ترکیه وارد ایران شده، در دو مسیر متفاوت، به سمت شمال و غرب در امتداد رشته کوه‌های البرز و زاگرس پراکنش یافته است. پراکنش این گونه در امتداد ساحل دریاچه شور ارومیه، مؤید قابلیت بالای این گونه در سازش با محیط‌های پر تنش به ویژه خاک‌های شور و قلیایی است. در گونهT. resupinatumدو گروه جغرافیایی مجزا شامل خزانه ژنی شمال-شمال‌شرق و غرب-جنوب‌غرب مشاهده شد. این گروه‌بندی، منطبق با پراکنش جغرافیایی ناشی از سازگاری این گونه با محیط است. البته آثاری از نفوذ خزانه ژنی غرب-جنوب‌غرب در خزانه ژنی شمال-شمال‌شرق نیز مشاهده می‌گردد که با توجه به فاصله مکانی بین این خزانه‌های ژنی، به احتمال زیاد این اختلاط ناشی از دخالت انسان به واسطه انتقال بذر باشد. این نتایج را در آنالیز مؤلفه‌های اصلی (PCA) نیز به وضوح می‌توان مشاهده کرد (شکل 5).
دندروگرام حاصل از نشانگرهای SSR سطوح فروگونه‌ای (واریته‌ها) را به وضوح از هم جدا نکرد و این نشان می‌دهد که این نشانگر در جنس Trifoliumدر سطوح فروگونه‌ای کارآیی چندانی ندارد (شکل 4).
شکل 4- دندروگرام UPGMA بر مبنای میزان شباهت‌های حاصل از تحلیل داده‌های SSR با استفاده از ضریب جاکارد (J) در میان 19 جمعیت از گونه‌های T. fragiferumو T. resupinatum.N = شمال، NE = شمال‌شرق، NW = شمال‌غرب، W = غرب و SW = جنوب‌غرب. جمعیت‌هایی که توسط دایره احاطه شده‌اند نفوذی‌های خزانه ژنی غرب-جنوب‌غرب در خزانه ژنی شمال-شمال‌شرق در گونه
T. resupinatumهستند.
شکل 5- رسته‌بندی 19 جمعیت از گونه‌های T. fragiferumو T. resupinatum بر اساس دو مؤلفه اصلی اول (PCA) بر مبنای میزان شباهت‌های حاصل از تحلیل داده‌های SSR.N = شمال، NE = شمال‌شرق، NW = شمال‌غرب، W = غرب و SW = جنوب‌غرب.
نتایج حاصل از این مطالعه، حاکی از سطح بالای چندشکلی و انتقال‌پذیری ریزماهواره‌های معرفی شده برای T. pratense و T. repens به گونه‌های
T. fragiferumو T. resupinatumاست. بالا بودن انتقال‌پذیری نشان می‌دهد که این گونه‌ها از نظر ژنتیکی به هم نزدیک هستند و پس از جدایی، ژنوم آنها تغییرات زیادی را متحمل نشده‌اند. بنابراین، می‌توان از نشانگرهای مولکولی SSR مربوط به گونه‌های نزدیک به یکدیگر برای ارزیابی و تحلیل ژنوم در گونه‌های مختلف این جنس استفاده نمود. بر این اساس، تا زمانی که جفت آغازگرهای SSR اختصاصی برای T. fragiferumو T. resupinatum طراحی نشده است، می‌توان با ضریب اطمینان بالایی از آغازگرهای SSR به دست آمده از T. pratense و T. repens برای بررسی تنوع ژنتیکی آنها استفاده نمود.
از طرفی، به دلیل این که در این پژوهش استخراج DNA ژنومی به صورت جمعیتی انجام گرفت، امکان محاسبه تنوع درون جمعیتی و برون جمعیتی و مقایسه آنها به صورت عددی وجود نداشت. لذا، با توجه به اهمیت این دو گونه زراعی و مرتعی مطالعه دقیق‌تر تنوعات درون و برون جمعیتی در این دو گونه با استفاده از نشانگر SSR و یا سایر نشانگرهای مولکولی پیشنهاد می‌گردد.
)