Document Type : Original Article
Authors
Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Isfahan, Isfahan, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
مقدمه
متیلوتروف‌ها که گروهی از باکتری‌های کموارگانوتروف هستند قادرند از ترکیبات آلی یک کربنه مانند متان، متانول، متیل آمین، فرمات، کلرومتان و ترکیباتی نظیر آنها به عنوان منبع کربن و انرژی استفاده کنند. این باکتری‌ها که از نظر مورفولوژی تنوع زیادی دارند، اغلب هوازی هستند و به صورت گسترده در محیط‌های آبی و خاک یافت می‌شوند. جنس‌های گوناگونی از باکتری‌ها در این گروه قرار دارند از جمله: Hyphomicrobium، Methylobacterium، Methylomicrobium، Methylomonas وPseudomonas (Trotsenko and Doronina, 2003).
مشتقات کلردار متان ترکیبات شیمیایی پُر مصرفی هستند که در ساخت خنک‌کننده‌ها کاربرد زیادی دارند و در صنعت نیز به عنوان حلال استفاده می‌شوند. این ترکیبات پایداری بالایی دارند، به مقادیر مختلفی در آب قابل حل هستند، در تخریب لایه ازون نقش دارند و برخی نیز مانند CH2Cl2 آثار سمّی داشته و خاصیت کارسینوژنیک آنها در موجودات زنده مشخص شده است. بنابراین، آلاینده‌های محیطی مهمی هستند که مهم‌ترین راه حذف آنها از محیط، تجزیه زیستی است و باکتری‌های متیلوتروف مهم‌ترین گروه زیستی مصرف‌کننده این ترکیبات شناخته شده‌اند. لذا، کشت، جداسازی، شناسایی و مطالعه این باکتری‌ها از اهمیت خاصی برخوردار است (Leisinger and Braus-Stromeyer, 1995).
امروزه از روش‌های گوناگون از جمله روش‌های مولکولی مانند تحلیل توالی 16S rDNA در شناسایی و تاکسونومی باکتری‌ها استفاده می‌شود که گرچه روش نسبتاً دقیقی است اما فرآیندی وقت‌گیر و پُر هزینه است. از این رو، پژوهشگران به دنبال روش‌های ساده‌تر و سریع‌تر برای جایگزینی آن بوده‌اند. روش FTIR (Fourier Transform Infrared) که سابقه استفاده از آن در میکروبیولوژی به دهه ۱۹۵۰ بر می‌گردد، به تازگی به عنوان روشی مناسب برای مقایسه و شناسایی سریع باکتری‌ها مطرح شده است (Salman et al., 2010 و (Ammann and Brandl, 2011. این روش، فیزیکو-شیمیایی بوده، مبتنی بر اندازه‌گیری لرزش پیوندهای مولکولی ترکیبی است که به وسیله فرکانس مناسبی از پرتو مادون قرمز تحریک شده باشد. در حین عبور پرتو از میان یک نمونه طول موج‌های خاصی جذب شده، باعث لرزش‌هایی مانند کشیدگی، جمع‌شدگی و خمیدگی پیوندهای شیمیایی در ماده می‌شوند. گروه‌های عملکردی موجود در مولکول (نظیر OH، SH و NH) نقش مهمی در این فرآیند دارند. طیف‌های FTIR باکتری‌ها می‌توانند برای ارزیابی ترکیب کلی ساختار آنها از جمله پروتئین‌ها، اسیدهای چرب، کربوهیدرات‌ها، نوکلئیک اسیدها و لیپو پُلی ساکاریدها استفاده شوند (Duygu et al., 2009؛ (Davis and Mauer, 2010.
با توجه به نقش مهمی که باکتری‌های متیلوتروف از نظر پاکسازی آلاینده‌های محیطی دارند و اهمیت مطالعه آنها و به منظور بررسی کارآیی روش FTIR در شناسایی و تاکسونومی این باکتری‌ها و مقایسه آن با روش تحلیل توالی 16S rDNA این پژوهش انجام شد.
مواد و روش‌ها
جداسازی باکتری‌های متیلوتروف
برای غنی‌سازی اولیه این باکتری‌ها، از محیط‌کشت معدنی پایه حاوی 5/0 درصد متانول استفاده شد. اجزای سازنده این محیط شامل فسفات دی هیدروژن پتاسیم 36/1 گرم، سولفات منیزیم 3/0 گرم، سولفات آمونیوم 5/0 گرم، دی سدیم هیدروژن فسفات 13/2 گرم و کلرید کلسیم 99/1 میلی‌گرم، سولفات آهن ۱ میلی‌گرم، سولفات منگنز 35/0 میلی‌گرم، مولیبدات سدیم 5/0 میلی‌گرم و ویتامین B12 (در صورت نیاز) به میزان 5/2 میکروگرم بودند. این اجزا در یک لیتر آب مقطر حل شده و اسیدیته آن بر روی 2/7 تنظیم گردید. پس از استریل کردن محیط‌کشت و خنک شدن آن مقدار 5/0 درصد متانول به عنوان منبع کربن به آن اضافه، سپس 20 نمونه مختلف از آب و پساب (متعلق به محدوده شهر اصفهان) و صافی‌های دستگاه تصفیه آب آشامیدنی خانگی به محیط‌ها تلقیح شد. پس از گذشت حدود یک هفته، ایجاد کدورت در محیط به عنوان نشانه رشد باکتری‌ها در نظر گرفته شد و پس از آن برای جداسازی و خالص‌سازی باکتری‌ها از محیط‌کشت مورد اشاره که حاوی 5/1 درصد آگار بود استفاده شد (Ivanova et al., 2000).
شناسایی باکتری با استفاده از توالی 16S rDNA
پس از جداسازی باکتری‌ها، برای تکثیر ژن
16S rDNA با روش PCR و تعیین توالی آن ژنوم باکتری‌ها استخراج گردید، از روش جوشاندن برای این کار استفاده شد و برای نوعی از باکتری‌ها که دارای رنگدانه بودند از روش CTAB (Cetyltrimethylammonium Bromide) استفاده شد. در روش جوشاندن چند کلونی از باکتری در ۱۰۰ میکرولیتر آب مقطر دو بار تقطیر استریل در یک میکروتیوپ 5/1 میلی‌لیتری به صورت سوسپانسیون در آورده شد سپس، به مدت ۱۰ دقیقه در آب جوش جوشانده شد و پس از خنک شدن به مدت ۵ دقیقه در دور g1۰۰۰ سانتریفیوژ گردید. سپس، مایع رویی که حاوی DNA است به درون یک میکروتیوپ استریل جدید منتقل شد (Ntsaluba et al.,2011). در روش CTAB کشت مایع باکتری که در فاز لگاریتمی است سانتریفیوژ شده، سلول‌ها در بافر TE (Tris-HCl 10 میلی‌مولار + EDTA 1 میلی‌مولار، اسیدیته=8) سوسپانسیون گردید و پس از افزودن لیزوزیم، پروتئیناز K، SDS و انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد لیز شده، سوسپانسیون به صورت شفاف و چسبناک در آمد آنگاه با اضافه کردن NaCl و CTAB اجزای لیز شده سلولی رسوب کرده، با محلول فنل کلروفرم ایزوآمیل الکل از فاز آبی حاوی DNA جداسازی شد. در پایان، DNA توسط ایزوپروپانول رسوب داده شد و پس از شستشو با اتانول در بافر TEبه صورت سوسپانسیون در آمد Ivanova et al., 2000)؛ (Balachandar et al., 2008.
برای تکثیر بخشی از ژن 16S rDNA از دو پرایمر DG74 (3'-AGGAGGTGATCCAACCGC-5') و RW01 (3'-AACTGGAGGAAGGTGGGG-5'). (TAG Copenhagen, Denmark) استفاده شد که قطعه‌ای در حدود ۳۷۰ جفت باز از این ژن را تکثیر می‌کند. مخلوط واکنش PCR در هر ۲۵ میکرولیتر شامل: ۲ میکرولیتر (۱۰ میکرومولار) از هرکدام از پرایمرها، 5/2 میکرولیتر بافر X۱۰ PCR، 5/0 میکرولیتر (۱۰ میلی‌مولار) dNTPs، 7/0 میکرولیتر (۵۰ میلی‌مولار) کلرید منیزیم، ۲ میکرولیتر DNA الگو، 25/0 میکرولیتر (25/0 واحد) Taq DNA pol (شرکت سیناژن ایران) و 05/17 میکرولیتر آب مقطر دو بار تقطیر استریل بود. PCR در دستگاه ترموسایکلر اپندورف انجام گرفت. برنامه شامل واسرشت شدن اولیه در دمای ۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه و به دنبال آن ۳۰ دور با ۹۴ درجه سانتیگراد به مدت ۴۵ ثانیه، ۵۸ درجه به مدت ۳۰ ثانیه، ۷۲ درجه به مدت ۴۵ ثانیه و یک مرحله نهایی سنتز در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه بود (Marchesi et al., 1998؛ (Balachandar et al., 2008.
تعیین توالی محصول PCR ژن 16S rDNA، شناسایی باکتری‌ها و ترسیم درخت فیلوژنیک
پس از تکثیر قطعه ۳۷۰ جفت بازی از ژن
16S rDNA با روش PCR و بررسی تک باند بودن و عدم آلودگی آن به وسیله الکتروفورز بر روی ژل آگاروز، محصول به سفارش شرکت تکاپو زیست با روش Sanger در شرکت Bioneer کشور کره تعیین توالی گردید. توالی‌های به دست آمده با هر یک از پرایمرها با نرم‌افزار BioEdit نسخه 7/1/7 با یکدیگر هم‌تراز (align) شدند. سپس، با بررسی کروماتوگرام‌های هر یک از این توالی‌ها با نرم‌افزار Chromas Pro نسخه 4/7/1 و اعمال موارد لازم، توالی‌هایی با طول حدود ۳۷۰ نوکلئوتید به دست آمد. در این حالت چون هر نوکلئوتید طی فرآیند توالی‌یابی دو بار خوانده می‌شود، خطای احتمالی به ویژه در ابتدا و انتهای توالی با نرم‌افزارهای اشاره شده قابل اصلاح است. برای شناسایی باکتری‌ها توالی‌های به دست آمده برای هر یک از آنها در پایگاه داده‌های NCBI، توالی‌یابی گردید و با توجه به میزان تشابه و تطابق این توالی‌ها با توالی‌های مرجع (reference sequences) موجود در این پایگاه داده‌ها شناسایی باکتری‌ها انجام شد. علاوه بر این، برای بررسی تاکسونومی این باکتری‌ها و برای ترسیم درخت فیلوژنی با استفاده از توالی 16S rDNA، تعدادی از توالی‌های نزدیک به هر یک از باکتری‌های مورد نظر نیز از NCBI استخراج گردید. از نرم‌افزار MEGA5 برای تحلیل داده‌ها استفاده شد. پس از وارد کردن توالی‌ها و هم‌تراز کردن آنها، از روش تحلیل The average-linkage-between-groups method که اغلب به UPGMA (Unweighted Pair-Group Method using. Arithmetic Averages) شناخته می‌شود، استفاده شد و با این روش الگوریتمی و با بوت‌استرپ ۵۰۰ درخت فیلوژنی ترسیم شد Oberreuter et al., 2002)؛ Lin et al., 2007).
شناسایی باکتری با روش FTIR
آماده‌سازی نمونه‌های باکتری: ابتدا باکتری‌ها روی محیط نوترینت آگار کشت داده شدند. پس از رشد باکتری‌ها، کلونی آنها با آب مقطر استریل از سطح محیط‌کشت شستشو و در میکروتیوب‌های 5/1 میلی‌لیتری جمع‌آوری شدند. سپس به مدت ۵ دقیقه در g۱۰۰۰۰ سانتریفیوژ شد. آنگاه محلول رویی خارج و سلول‌ها دست کم سه مرتبه دیگر با آب مقطر استریل شستشو شدند. پس از آخرین شستشو، با خارج نمودن کامل مایع رویی درب میکروتیوب‌ها باز گذاشته شد و به مدت یک شب در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد درون آون قرار داده شدند تا آب آنها تبخیر و کاملاً خشک شود Zhao et al., 2006)؛ (Davis and Mauer, 2010.
تهیه نمونه برای FTIR: مقدار اندکی از جسم سلولی خشک شده هر باکتری با مقدار مساوی از پتاسیم بروماید (KBr) در هاون مخصوصی مخلوط و به صورت پودر درآورده شد. این پودر بر روی دیسک کریستالی کوچکی قرار داده شد و دیسک به کمک جک مخصوصی تحت فشار قرار گرفت تا پودر بر روی آن تثبیت گردد Zhao et al., 2006)؛ Davis and Mauer, 2010).
طیف‌سنجی FTIR، مقایسه باکتری‌ها و رسم درخت فیلوژنی: پس از آماده‌سازی نمونه، دیسک به دستگاه Spectroscope, FT/IR-6300 (JASCO, Japan) منتقل شد و طیف حاصل از سنجش مقدار عبور در محدوده عدد موج 400-4000 بر سانتی‌متر (cm-1) به دست آمد. اطلاعات به دست آمده از طیف‌سنجی با نرم‌افزار Spektwin32 نسخه 1/6/71/1 (Friedrich Menges, Germany) بررسی و پردازش شد و نتایج آن برای رسم درخت فیلوژنی با نرم‌افزار SPSS نسخه 20 استفاده شد (Rodriguez-Saona et al., 2004؛ Davis and Mauer, 2010؛ Ammann and Brandl, 2011).
در بررسی طیف مادون قرمز (IR) بر روی باکتری‌ها به طور مشخص پنج ناحیه برای شناسایی باکتری‌ها بایستی مورد بررسی و تجزیه و تحلیل قرار بگیرد. نخستین ناحیه طیف cm-1 28۰۰-3000 مربوط به اسیدهای چرب است. طیف cm-1 ۱7۰۰-۱5۰۰ که ناحیه دوم را تشکیل می‌دهد شامل پیوندهای آمیدی I و II پروتئین‌ها و پپتیدهاست. ناحیه سوم که طیف
cm-1 ۱5۰۰-۱2۰۰ را در بر می‌گیرد ناحیه مخلوطی شامل لرزش‌های خمیدگی اسیدهای چرب، پروتئین‌ها و ترکیبات حاوی فسفات است. ناحیه چهارم که در بر دارنده باندهای جذبی کربوهیدرات‌ها در دیواره سلولی باکتری‌هاست cm-1 900-12۰۰ را شامل می‌شود و ناحیه پنجم cm-1 7۰۰-9۰۰ که ناحیه معروف به اثر انگشت است و شامل باندهای جذبی ضعیف اما کاملاً منحصر به فرد است و برای هر باکتری اختصاصیت بالایی را دارد (Davis and Mauer, 2010).
در یک نگاه کلی به طیف‌های باکتری‌ها، تمام آنها شبیه به هم دیده می‌شوند و شاید نتوان اختلاف زیادی بین آنها دید اما مشتق آنها تفاوت‌های معنی‌داری را در طیف‌ها مشخص‌تر می‌کند و از آن می‌توان برای ارزیابی شباهت‌ها و تفاوت‌ها در باکتری‌ها استفاده کرد. برای به دست آوردن عدد موج‌های مناسب جهت تفکیک و تمایز باکتری‌ها از یکدیگر علاوه بر استفاده از عدد موج‌های ذکر شده در منابع، از نرم‌افزار Spekwin32 نیز استفاده شد. پس از باز کردن فایل طیف‌های مربوط به تمام باکتری‌ها به صورت همپوشان در محیط نرم‌افزار و smoothing آنها و سپس حذف طیف‌های smooth نشده و normalize کردن آنها مشتق دوم طیف‌ها به دست آمد تا بدین وسیله نواحی و عدد موج‌های حفاظت شده و معنی‌داری که نشان‌دهنده وجود اختلاف بین طیف‌های باکتری‌های مختلف هستند، مشخص شوند. پس از مشخص کردن این عدد موج‌ها میزان عبور (transmittance) در باکتری‌های مختلف تعیین گردید. در مجموع، از ناحیه ۷۰۰ تا ۱۷۰۰ و ۲۸۰۰ تا ۳۰۰۰ حدود ۱۸ عدد موج مشخص برای این منظور در نظر گرفته شد Holt et al. 1995)؛ Lin et al.,2004؛ (Davis and Mauer, 2010.
آنگاه میزان عبور برای هر یک از باکتری‌ها در عدد موج‌های مورد نظر مشخص و اطلاعات به دست آمده شامل دو شاخص عدد موج و میزان عبور در نرم‌افزار SPSS نسخه 20 وارد شد. برای تحلیل داده‌ها و گروه‌بندی باکتری‌ها با استفاده از داده‌های ذکر شده، از تحلیل خوشه‌ای HCA (Hierachical Cluster Analysis) با به کارگیری روش UPGMA (Between-groups Linkage) و فاصله مربع اقلیدسی (squared euclidian distance) استفاده شد. دومین روش استفاده شده برای تحلیل داده‌ها، روش تحلیل مؤلفه‌های اصلی یا PCA (Principal Component Analysis) بود که روشی رایج برای تشخیص الگو است و به طور گسترده برای تفسیر واریانس در داده‌های طیفی استفاده می‌شود Holt et al., 1995)؛ Lin et al.,2004؛ (Davis and Mauer, 2010.
نتایج
در این مطالعه، ابتدا تعداد ۳۰ باکتری از نمونه‌های مختلف آب، پساب و صافی‌های تصفیه آب آشامیدنی خانگی جداسازی شدند که با توجه به نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی و بررسی مورفولوژی زیر میکروسکوپ و همچنین ویژگی‌های ظاهری کلونی‌ها از میان آنها هفت باکتری برای ادامه کار انتخاب و به ترتیب A، B، C، D، E، G و H نامیده شدند.
از بین این هفت باکتری یکی از آنها یعنی A متیلوتروف اجباری بود که تنها بر روی محیط‌کشت حاوی متانول رشد کرده، کلونی‌های بی‌رنگ تا قهوه‌ای کمرنگ تشکیل داد. باکتری E هم یک باکتری گرم‌منفی با کلونی‌های صورتی تا نارنجی‌رنگ و مانند سایر باکتری‌ها متیلوتروف اختیاری بود. باکتری B دارای کلونی‌های زرد رنگی بود و کمترین میزان رشد متیلوتروفی را داشت. باکتری C نیز که دارای کلونی‌های سفید رنگ و شفافی بود رشد متیلوتروفی نسبتاً خوبی داشت. باکتری‌های D و H نیز شبیه هم بودند و کلونی‌های ریز و شیری رنگ داشتند. باکتری G نیز کلونی‌های زرد کمرنگی را تشکیل داد و رشد متیلوتروفی خوبی داشت.
در هم‌تراز کردن توالی‌ها در نرم‌افزار BioEdit، اختلاف کلی بین توالی مربوط به باکتری E با سایر باکتری‌ها مشاهده گردید (شکل ۱) و این بدان معنی است که احتمالاً این باکتری از باکتری‌های دیگر متمایز است.
با توجه به نتایج حاصل از توالی‌یابی باکتری‌ها در NCBI مواردی که دارای کمترین ارزش مورد انتظار (= صفر)، بیشترین درصد تشابه و بالاترین امتیاز برای هر یک از توالی‌ها بودند به عنوان ملاکی برای شناسایی مورد استفاده قرار گرفتند (جدول ۱).
برای بررسی روابط تاکسونومیک باکتری‌ها ابتدا دندروگرامی با استفاده از توالی‌های هفت باکتری مورد مطالعه ترسیم شد (شکل ۲). همان طور که در این دندروگرام مشاهده می‌شود باکتری‌های D و H در کنار یکدیگر و در یک خوشه قرار گرفته‌اند و نزدیک‌ترین شاخه به آن شاخه‌ای است که باکتری A بر روی آن قرار گرفته است و این سه باکتری به همراه هم خوشه‌ای را تشکیل می‌دهند که از خوشه دیگری که باکتری‌های B و G را بر روی خود جا داده است، جدا شده‌اند. باکتری C در شاخه‌ای جداگانه از خوشه در بر گیرنده باکتری‌های A، D و H و B و G قرار دارد. باکتری E در شاخه جداگانه‌ای از تمام باکتری‌های دیگر جدا شده است.
شکل ۱- قسمتی از نتیجه هم‌تراز کردن توالی‌های 16S rDNA باکتری‌ها در نرم‌افزار BioEdit
جدول ۱- نتایج BLAST توالی‌های هر یک از باکتری‌ها در NCBI. مقدار همپوشانی توالی مورد نظر (query coverage) برای تمام جدایه‌ها ۹۹ درصد و ارزش مورد انتظار (E-value) برابر با صفر بود.
|
بیشترین شباهت |
بیشترین امتیاز |
نام گونه |
جدایه |
|
99 درصد |
664 |
Methylobacillus flagellatus |
A |
|
99 درصد |
671 |
Xantomonas campestris |
B |
|
100 درصد |
686 |
Klebsiella oxytoca |
C |
|
99 درصد |
675 |
Delftia acidivorans |
D |
|
99 درصد |
660 |
Methylobacterium populi |
E |
|
99 درصد |
671 |
Stenotrophomonas maltophilia |
G |
|
99 درصد |
675 |
Delftia acidivorans |
H |
شکل ۲- درخت فیلوژنتیک ترسیم شده با استفاده از توالی 16S rDNA با روش UPGMA برای هفت باکتری متیلوتروف جداسازی شده
همچنین، برای نشان دادن جایگاه این باکتری‌ها در میان باکتری‌های دیگر و بالا بردن دقت، توالی‌های نزدیک به هر یک از این باکتری‌ها نیز که از NCBI استخراج شده بودند مورد استفاده قرار گرفتند. نتایج به دست آمده دندروگرامی است که در شکل ۳ قابل مشاهده است.
|
شکل ۳- دندروگرام ترسیم شده با استفاده از توالی‌های باکتری‌های متیلوتروف مورد نظر و توالی‌های استخراج شده از NCBI که موقعیت تاکسونومیک این هفت باکتری را نشان می‌دهد. |
در این دندروگرام (شکل 3) نیز تقریباً همان ترتیب جدا شدن باکتری‌ها و قرار گرفتن آنها در شاخه‌ها و خوشه‌ها در میان باکتری‌های دیگر مشاهده شد البته با این تفاوت که باکتری C که در شاخه جداگانه‌ای قرار گرفته بود در دندروگرام جدید در همسایگی خوشه‌ای قرار دارد که باکتری‌های A، D و H بر روی آن قرار دارند و در واقع به این سه باکتری نزدیکتر است تا به باکتری‌های G و B. در این دندروگرام نیز باکتری E در شاخه‌ای به صورت کاملاً مستقل از شش باکتری دیگر قرار گرفته است.
طیف عبوری باکتری‌های مختلف در محدوده
cm-1 ۴0۰-۴۰0۰ در شکل ۴ نشان داده شده است. نکته شایان توجه این است که در یک نگاه کلی طیف‌ها شباهت زیادی به یکدیگر دارند و نمی‌توان تفاوت چندانی بین آنها مشاهده کرد. اما چنان که در شکل ۵ نشان داده شده است با مشتق گرفتن از این طیف‌ها بخش‌هایی از آنها حذف شده، در نواحی باقی مانده بخش‌های مشترک و عدد موج‌های ارزشمندی برای مقایسه طیف‌های باکتری‌های مختلف را مشخص می‌کند.
شکل ۴- طیف عبوری باکتری‌های مختلف در محدوده cm-1 ۴۰0۰-۴۰۰، در یک دید کلی طیف‌ها شباهت زیادی به یکدیگر دارند.
شکل ۵- بخشی از مشتق طیف‌های عبوری باکتری‌ها (cm-1 ۱8۰۰-۱2۰۰). در این شکل نواحی حفاظت شده عدد موج‌ها را می‌توان مشاهده کرد که نواحی ارزشمند به منظور بررسی در باکتری‌های مورد مطالعه هستند.
نتیجه حاصل از تحلیل داده‌ها با نرم‌افزار SPSS نسخه 20 با روش HCA دندروگرامی است که در شکل ۶ نشان داده شده است. چنان که در این دندروگرام مشاهده می‌شود همانند دندروگرام ترسیم شده با MEGA5 باکتری‌های D و H در کنار هم، در یک خوشه از باکتری A جدا شده‌اند اما این سه باکتری با شباهت بیشتری که به هم داشته‌اند خوشه‌ای را تشکیل داده و از سایر باکتری‌ها جدا گردیده‌اند. دو باکتری B و G نیز در کنار هم یک خوشه را تشکیل داده و از باکتری C جدا شده‌اند ولی هر سه آنها نیز با توجه به نزدیکی‌شان به یکدیگر بر روی یک خوشه قرار گرفته و از سه باکتری قبل جدا شده‌اند. در اینجا نیز همانند دندروگرام ترسیم شده با اطلاعات توالی 16S rDNA، باکتری E اساساً به صورت یک شاخه مستقل از سایر باکتری‌ها جدا شده است. نکته جالب توجه در اینجا شباهت قابل ملاحظه‌ای است که دندروگرام ترسیم شده با اطلاعات توالی‌های نوکلئوتیدی با دندروگرام ترسیم شده با روش FTIR و بر اساس اطلاعات فیزیکو-شیمیایی ساختار باکتری دارد و به طور کلی اختلاف اصلی این دو نمودار مربوط به جایگاه باکتری C است.
شکل ۶- دندروگرام حاصل از HCA با روش UPGMA بر روی داده‌های FTIR مربوط به هفت باکتری متیلوتروف
نتیجه حاصل از تحلیل داده‌های FTIR با استفاده از نرم‌افزار SPSS با روش PCA برای هفت باکتری متیلوتروف مطالعه شده در شکل ۷ نشان داده شده است. چنان که مشاهده می‌شود الگوی تمایز و جدایی آنها از یکدیگر تا حد زیادی شبیه به الگویی است که در روش HCA یا حتی 16S rDNA دیده می‌شود. دو باکتری D و H کاملاً نزدیک به هم قرار دارند و باکتری A نیز با فاصله اندکی در کنار آنها قرار گرفته است و می‌توان آنها را کاملاً به صورت دسته‌ای جداگانه در نظر گرفت. باکتری‌های B و G تا حدودی نزدیک به هم و با فاصله اندکی از بقیه باکتری‌ها قرار دارند و باکتری C نیز اندکی دورتر از آنها قرار گرفته است. اما باکتری E کاملاً مجزا و دور از سایر باکتری‌ها قرار دارد و تمایز آشکاری را با بقیه نشان می‌دهد.
شکل ۷- نتیجه حاصل از تحلیل داده‌های FTIR با روش PCA
بحث و نتیجه‌گیری
تحلیل توالی 16S rDNA امروزه به عنوان روشی استاندارد و قابل قبول برای شناسایی و تاکسونومی باکتری‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد اما روشی وقت‌گیر و پُر هزینه محسوب می‌شود. بنابراین، یافتن روش‌های قابل اطمینان اما سریع‌تر و ارزان‌تر برای این منظور یکی از نکات مورد توجه پژوهشگران بوده است که FTIR یکی از این روش‌هاست. طی چندین سالی که از مطرح شدن FTIR به عنوان روشی کاربردی در میکروبیولوژی می‌گذرد پژوهش‌های مختلفی در این زمینه صورت گرفته است. Davis و Mauer (۲۰۱۰) معتقدند این روش می‌تواند برای تشخیص، تفکیک و سنجش کمّی باکتری‌ها جایگزین ابزارهای تشخیصی رایج در صنایع غذایی، دارویی و آزمایشگاه‌های تشخیص طبی گردد. Duygu و همکاران (۲۰۰۹) مزایای FTIR را سرعت بالای آن نسبت با روش‌های رایج و اختصاصیت آن می‌دانند که می‌تواند در اپیدمیولوژی و کنترل آلودگی‌ها به کار رود. Ammann و Brandl (۲۰۱۱) مزیت FTIR را نیاز به مقادیر اندک نمونه و اختصاصیت بالای آن برای تشخیص اسپور باکتری‌ها حتی در حضور سایر مواد آلی در خاک ذکر می‌کنند. بررسی‌های دیگری نیز که در این زمینه صورت گرفته بیشتر بر روی تشخیص و کنترل پاتوژن‌ها در آب، مواد غذایی و نوشیدنی‌ها متمرکز بوده است که از آن جمله می‌توان به
Al-Qadiri و همکاران (۲۰۰۶ و ۲۰۰۸)، Holt و همکاران (۱۹۹۵)، Lin و همکاران (۲۰۰۴) و Rodriguez و همکاران (۲۰۰۴) اشاره کرد. عیب بزرگی که برخی از این پژوهشگران بر آن تأکید می‌کنند نبود بانک جامع اطلاعاتی برای داده‌های طیفی باکتری‌ها در روش FTIR است (Al-Qadiri et al., 2006؛ (Ammann and Brandl, 2011.
علاوه بر موارد اشاره شده، برخی از پژوهشگران کارآیی FTIR را به عنوان روشی مناسب برای استفاده در تاکسونومی باکتری‌ها نیز ارزیابی کرده‌اند که برخی آن را تأیید و نتایج آن را قابل مقایسه با روش
16S rDNA و حتی بهتر از آن می‌دانند و برخی نیز آن را زیر سؤال برده‌اند اما تاکنون توافق نظر کاملی بر روی این مسأله وجود نداشته است Zhao et al., 2006)؛ (Davis and Mauer, 2010.
نتایج به دست آمده از پژوهش حاضر برای مقایسه روش‌های FTIR و 16S rDNA و کارآیی آنها در شناسایی و تاکسونومی باکتری‌های متیلوتروف نشان داد که FTIR روش مناسبی برای تشخیص و تفکیک و تمایز باکتری‌ها از یکدیگر است که می‌توان نتایج آن را با روش 16S rDNA قابل مقایسه دانست. در مورد باکتری‌های D و H توالی 16S rDNA آنها کاملاً شبیه به هم بوده، هیچ تفاوتی را نشان نمی‌دهند اما طیف‌های FTIR این دو باکتری هرچند شبیه هم هستند اما کاملاً یکسان و منطبق بر هم نیستند. این یافته تأیید کننده یافته‌های Zhao و همکاران (۲۰۰۶) است. آنها توانستند با استفاده از FTIR و تحلیل نتایج آن با PCA چهار جدایه از Streptomyces را که از نظر توالی
16S rDNA صد در صد با هم شباهت داشتند اما بر اساس ظاهر میسلیوم، اسپور و رنگدانه با هم متفاوت بودند، از یکدیگر تفکیک کنند.
با توجه به این که در این تحقیق مطالعه باکتری‌ها در سطح جنس صورت گرفته است کارآیی روش FTIR را می‌توان تنها در این سطح با اطمینان تأیید کرد. اما این که روش مذکور تا چه سطحی می‌تواند برای تمایز باکتری‌ها کارآیی داشته باشد نیاز به بررسی بیشتر دارد. Oberreuter و همکاران (۲۰۰۲) که تنوع درون‌گونه‌ای را در سه باکتری اکتینومیست Brevibacterium linens،Corynebacterium glutamicum و Rhodococcus erythropolis با استفاده از هر دو روش بررسی کرده‌اند، معتقدند که کارآیی FTIR تنها تا سطح گونه است و در سطح زیرگونه نمی‌تواند معیار مناسبی برای بررسی ارتباط تاکسونومیک باشد. زیرا هرچند با این روش تنوعاتی در سطح زیرگونه دیده می‌شود اما این تنوعات متفاوت از تنوعاتی است که با روش 16S rDNA بین سویه‌ها مشاهده می‌شود.
در مقایسه نتایج به دست آمده برای گروه‌بندی باکتری‌ها، به جز جایگاه باکتری C نتایج تا حد بسیار زیادی در هر دو روش مشابه یکدیگرند. با توجه به این که روش‌های آماری مختلف برای تفسیر داده‌های FTIR نتایج کاملاً یکسانی ندارد بنابراین جایگاه باکتری‌ها در هر روش می‌تواند با روش دیگر متفاوت باشد و این امر اهمیت چگونگی تحلیل داده‌ها و تفسیر نتایج را بیشتر مشخص می‌کند.
با توجه به نتایج به دست آمده کارآیی FTIR را نه می‌توان کاملاً تأیید و نه کاملاً رد کرد شاید تلفیقی از هر دو روش نتیجه بهتری در بر داشته باشد. بر اساس یافته‌های Lin و همکاران (۲۰۰۷) برای تحلیل فیلوژنیک جدایه‌هایی از باکتری Alicyclobacillus با استفاده از دو روش FTIR و 16S rDNA ترکیبی از هر دو روش است که می‌تواند ابزار مناسبی برای شناسایی و تمایز سریع و مطمئن باکتری‌ها فراهم کند.
علاوه بر موارد ذکر شده درباره حساسیت و دقت روش FTIR مزیت مهم دیگری که می‌توان به آن اشاره کرد این است که تجهیزات و وسایل زیادی نیاز ندارد و میزان مواد مورد استفاده در این روش نیز قابل مقایسه با روش 16S rDNA نیست به طوری که می‌توان گفت در روش FTIR تقریباً هیچ ماده دیگری به جز KBr استفاده نمی‌شود و بنابراین از نظر هزینه بسیار ارزان‌تر و به صرفه‌تر است. مزیت مهم دیگر زمان بسیار اندکی است که برای انجام آزمون بر روی هر نمونه در روش FTIR مورد نیاز است که این زمان از چند دقیقه تجاوز نمی‌کند در حالی که در روش
16S rDNA این زمان به چندین ساعت می‌رسد.
نکته آخر این که بر خلاف توالی 16S rDNA که بانک‌های اطلاعاتی و پایگاه داده‌های بزرگ و رو به گسترشی دارد، تاکنون چنین مرجعی برای داده‌های FTIR باکتری‌ها فراهم نشده است که این بزرگترین عیب روش FTIR بوده و محدودیت زیادی برای کاربردی شدن این روش و استفاده از آن برای بررسی‌های تاکسونومیک و فیلوژنیک در سطح وسیع به وجود آورده است.
)