Document Type : Original Article
Authors
Department of Biology, Faculty of Sciences, Payame Noor University, PO BOX 19395-3697 Tehran, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
مقدمه
پروتئینها، محصولات نهایی مسیرهای ژنتیکی هستند که در مراحل مختلف حیات سلول و در پاسخ به نیازهای سلولی تولید و به سوی جایگاههای مناسب هدفگیری میشوند (Nelson and Cox, 2007). در میان انواع پروتئینهای گیاهی، پروتئینهای ذخیرهای بذر (SSPs) که در سطوح بالا و در مراحل انتهایی نمو بذر گیاهان در آنها تجمع مییابند (Sánchez-Romero et al; 2002؛ (Sergeant et al., 2009 به عنوان ابزاری برای بررسی تنوع ژنتیکی بسیار مورد توجه قرار گرفتهاند. مطالعه SSPs اطلاعات مهمی در مورد روابط خویشاوندی در گیاهان به ویژه گیاهانی با ارزش غذایی بالا به دست میدهد. به دلیل ثابتتر بودن نوع و میزان SSPs در بذرهای بالغ نسبت به سایر بافتهای گیاهی (Magni et al., 2007)، تحلیل آنها میتواند ابزاری برای شناسایی ارقام و گونههای گیاهی باشد (Kakaei and Kahrizi, 2011). در مقابل، پروتئینهای رویشی (VSPs) (پروتئینهای موجود در بافتهای رویشی گیاه مانند: ریشهها، ساقهها، برگها و غدهها) تحت تأثیر شرایط محیطی و تنشها قرار میگیرند (Tamkoc and Arsalan, 2010).
کلزا (Brassica napus)، به خانواده چلیپائیان (Brassicaceae)، از گیاهان زراعی مهم در مدیترانه و برخی مناطق خاورمیانه متعلق است (Bybordi, 2010) که به عنوان یک گیاه دانه روغنی با ارزش در سراسر جهان کشت میشود (Sadia et al., 2009). درصد بالای پروتئین و اسیدهای چرب غیر اشباع مانند اولئیک اسید، همچنین میزان اندک اسیدهای چرب اشباع موجود در بذرهای این گیاه ارزش غذایی و اقتصادی آن را افزایش داده است (Nasr et al., 2006). کلزا دانههایی با ۴۰ درصد روغن و حدود ۱۵ درصد پروتئین (به عنوان ترکیبات ذخیرهای اصلی) تولید میکند Norton and Harris, 1975)؛ Gunstone et al., 1995). مطالعات مولکولی و بیوشیمیایی، مسیرهای بیوسنتزی مسؤول تولید و تجمع پروتئین و روغن را در بذر B. napus مشخص کردهاند (Rawsthorne, 2002؛ Schwender and Ohlrogge, 2002؛ Hill et al., 2003؛ Schwender et al., 2003، Goffman et al., 2004؛ Kubis et al., 2004؛ Ruuska et al., 2004). با وجود اینکه امروزه استفاده از تکنیکهای الکتروفورز دو بعدی (2-DE) و روشهای شناسایی پروتئین به وسیله اسپکتروفتومتر جرمی (MS) گسترش یافته است Aebersold and Mann, 2003)؛ Gorg et al., 2003؛ (Agrawal et al., 2005، بررسی SSPs با استفاده از ژل الکتروفورز یک بعدی، به ویژه
SDS-PAGE، همچنان به عنوان روشی ساده، سریع، ارزان و رایج برای مطالعه و مقایسه تفاوت الگوی پروتئینی ارقام و گونههای مختلف گیاهی و تنوع ژنتیکی آنها مطرح است. از آنجا که بررسی تنوع ژنتیکی نقش مهمی در به نژادی ژنتیکی گیاهان ایفا میکند، کاربرد نشانگرهای پروتئینی نظیر SSPs در مطالعه تنوع ژنتیکی ژرمپلاسم به منظور استفاده در برنامههای اصلاح نباتات بسیار مورد توجه است (Javid et al., 2004). الگوی الکتروفورزی پروتئینهای ذخیرهای بذر در مطالعات قبلی نیز استفاده شده است. برای نمونه نشانگرهای پلیمورفیسم ژنتیکی گونههای Brassica در بنگلادش، ژاپن، چین و دانمارک با روش SDS-PAGE توسط Rahman و Hirata (2004) تشخیص داده شد. همچنین، Kakaei و Kahrizi (2011) به مطالعه پروفایل پروتئینهای ذخیرهای دانه در ارقام مختلف B. napus و تنوع ژنتیکی آنها پرداختند.
با توجه به ارزش غذایی و اقتصادی بسیار بالای ارقام مختلف کلزا و به دلیل محدود بودن اطلاعات موجود در مورد تفاوتهای پروتئینی (Rahman and Hirata, 2004) و تنوع ژنتیکی میان آنها، مطالعه حاضر به منظور تکمیل اطلاعات در زمینه آنالیزهای مقایسهای و تنوع ژنتیکی ارقام مختلف کلزا به وسیله الکتروفورز یک بعدی (SDS-PAGE) صورت گرفته، شناسایی برخی ارقام منتخب کلزا با استفاده از نشانگرهای پروتئینی ذخیرهای بذر و مقایسه با پروتئینیهای رویشی (برگهای لپهای) انجام گردیده است. به دلیل وابستگی جوانهزنی بذر به لپهها به ویژه در مراحل ابتدایی رشد، الگوی پروتئینی برگهای لپهای پس از گذشت پنج روز از کشت در محیط MS نیز توسط SDS-PAGE بررسی شد.
مواد و روشها
مواد گیاهی و شرایط کشت
بذر چهار رقم کلزا (الایت، اکاپی، تاسیلو و زرفام) از مرکز تولید دانههای روغنی وزارت جهاد کشاورزی استان اصفهان تهیه شد. دانههای بالغ هر رقم پس از ضدعفونی با الکل ۷۰ درصد به مدت ۳۰ تا ۶۰ ثانیه و آب ژاول 20 درصد به مدت ۱۵ دقیقه، ۴ تا ۵ مرتبه در زیر لامینار و تحت جریان هوای استریل شستشو و در محیط کشت MS (Murashige and Skoog, 1962) حاوی ۱ درصد آگار، ۳ درصد سوکروز کشت داده شدند. شیشههای کشت حاوی بذر در اتاق رشد با شرایط تنظیم شده دمایی و در فتوپریود 16/8 ساعت نور/تاریکی به مدت ۴ هفته قرار گرفتند تا گیاهان رشد نمایند و پس از پنج روز از برگهای لپهای هر رقم به منظور استخراج پروتئین و ژل الکتروفورز یک بعدی استفاده شد.
استخراج پروتئین بذر و برگهای لپهای
پس از جداسازی پوسته 50 بذر از هر رقم، لپهها و رویان موجود در بذرها با استون چربیزدایی شده، پودر فاقد چربی (defatted powder) لپهها و رویان حاصل از هر رقم پس از خشک شدن در دمای اتاق برای استخراج SSPs استفاده شد (Ehsanpour et al., 2010). استخراج پروتئین با استفاده از بافر استخراج حاوی 50 میلیمولار تریس، اسیدیته 5/7، 1 میلیمولار DTT، 2 میلیمولار Na2EDTA، 3 میلیمولار
2-مرکاپتواتانول و به نسبت ۱ به ۳۰ (وزنی/حجمی) بر اساس روش Rostami و Ehsanpour (2009) انجام شد. سوسپانسیون حاصل به مدت ۲ تا ۳ ساعت روی شیکر مدل POLE IPI PARS با سرعت ۵۰ دور در دقیقه تکان داده شد، سپس به مدت 25 دقیقه در rpm ۱۰۰۰۰ و ۴ درجه سانتیگراد توسط سانتریفیوژ مدل 3k20 SIGMA سانتریفیوژ گردید. پروتئینهای ذخیرهای موجود در محلول رویی هر رقم کلزا توسط استون سرد به نسبت ۱ به 4 (حجمی/حجمی) رسوب داده شد و به مدت 25 دقیقه در 20- درجه سانتیگراد نگهداری و مجدداً به مدت ۲5 دقیقه در rpm ۱۰۰۰۰ و ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شدند. در نهایت، رسوب پروتئینی هر رقم به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق خشک شد و در ۴۰۰ میکرولیتر از بافر استخراج مذکور همگن و به مدت ۱۵ دقیقه با شرایط قبلی سانتریفیوژ شد. به طور مشابه، استخراج پروتئین از برگهای لپهای کلزا (1/0 گرم بافت) صورت گرفت و در نهایت، رسوب پروتئینی هر رقم در ۵۰۰ میکرولیتر از بافر استخراج مذکور همگن و به مدت ۱۵ دقیقه در rpm ۱۰۰۰۰ و ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژ و برای اندازهگیری میزان پروتئین کل و بررسی الگوی پروتئینی استفاده شد.
سنجش پروتئین کل و SDS-PAGE
اندازهگیری پروتئین کل (mg/g defatted powder) بر اساس روش تغییر یافته Bradford (1976)، با استفاده از BSA به عنوان پروتئین استاندارد انجام (Olson and Markwell, 2007) و پس از یکسانسازی نمونهها، الگوی الکتروفورزی (SDS-PAGE) پروتئینهای ذخیرهای بذر و پروتئینهای برگهای لپهای با استفاده از ژل جداکننده (separating) 5/12 درصد و ژل متراکم کننده (stacking) ۵ درصد به وسیله تانک الکتروفورز ساخت شرکت PEQLAB مدل 1614-45 و با استفاده از نشانگر پروتئینی Preotein ladder PLUS PS11 در ۱۳۰ ولت انجام شد. پس از رنگآمیزی ژل با نیترات نقره (Salehi and McCarthy, 2002)، تراکم نسبی باندهای پروتئینی با نرمافزار ImageJ بررسی شد. روابط خویشاوندی ارقام Brassica بر پایه حضور یا عدم حضور باندهای پروتئینی در ژل به وسیله تحلیل خوشهای UPGMA و ضریب Jaccard در نرمافزار NTSYSpc2 تحلیل شد (Rohlf, 2000). همه آزمایشها در ۳ تکرار انجام و دادههای حاصل توسط نرمافزار Sigma state 2 و تحلیل ANOVA و آزمون دانکن در سطح معنیداری P<0.05 مقایسه شدند.
مشاهدات
اندازهگیری پروتئین محلول کل SSPs در لپهها و رویان چهار رقم کلزا شامل الایت، اکاپی، تاسیلو و زرفام تفاوت معنیداری نشان نداد، در حالی که پروتئین محلول کل برگهای لپهای در برخی ارقام متفاوت بود. رقم تاسیلو بیشترین میزان پروتئین محلول کل را نسبت به سایر ارقام دارا بود و ارقام الایت و زرفام از نظر محتوای پروتئین کل تفاوتی نداشتند (شکل ۱).
شکل ۱- (A میزان پروتئین محلول کل پروتئینهای ذخیرهای بذر (SSPs) در لپهها و رویان در چهار رقم کلزا به ترتیب شامل: تاسیلو (T)، الایت (El)، زرفام (Z) و اکاپی (Oc)؛ (B میزان پروتئین محلول کل برگهای لپهای. dp: پودر فاقد چربی (defatted powder). دادهها میانگین ۳ تکرار± Std و حروف نامشابه نشاندهنده اختلاف معنیدار در سطح P<0.05 بر اساس آزمون دانکن است.
بررسی الگوی پروتئینی بذر و برگهای لپهای چهار رقم کلزا با استفاده از SDS-PAGE و آنالیز باندهای پروتئینی با نرمافزار ImageJ، تفاوت معنیداری در بیان نسبی ۶ باند پروتئینی در دانهها و برگهای لپهای ارقام کلزا مشخص کرد. نتایج این بررسی نشان داد که باندهای پروتئینی ۱ و ۲ به ترتیب با وزن تقریبی 110 و 80 کیلو دالتون در بذر ارقام تاسیلو و الایت کمترین سطح بیان و باند ۶ (۲۰ کیلو دالتون یا کمتر) در رقم اکاپی بیشترین سطح بیان را داشت. علاوه بر این، بیان باندهای ۳ (با وزن تقریبی 67 کیلو دالتون) و ۴ (با وزن تقریبی 62 کیلو دالتون) در رقم اکاپی قابل تشخیص نبود، در حالی که باند ۵ (با وزن تقریبی ۴۵ کیلو دالتون) در ارقام تاسیلو و الایت مشاهده نشد (شکل ۲).
نتایج بررسی الگوی الکتروفورزی پروتئین در برگهای لپهای چهار رقم کلزا (شکل ۳) بیشترین میزان بیان باند ۱ با وزن تقریبی 80 کیلو دالتون را در رقم تاسیلو و سپس زرفام نشان داد. همچنین، باندهای ۲ (با وزن تقریبی 63 کیلو دالتون) و ۶ (با وزن تقریبی 3 کیلو دالتون) به ترتیب بیشترین سطح بیان را در ارقام تاسیلو و زرفام نشان دادند. افزایش سطح بیان باند ۴ (27 کیلو دالتون) در رقم تاسیلو تشخیص داده شد. باند پروتئینی با وزن مولکولی 63 کیلو دالتون (باند ۲) در رقم اکاپی مشاهده نشد در صورتی که بیان باندهای ۳ و ۵ به ترتیب با وزن تقریبی 51 و ۲۲ کیلو دالتون در رقم الایت تشخیص داده نشد. این بررسی نشان داد که رقم تاسیلو علاوه بر دارا بودن بیشترین محتوای پروتئین محلول کل نسبت به سایر ارقام، دارای بیشترین سطح بیان نسبی باندهای ۱، ۲ و ۴ نیز بود.
شکل ۲- (A الگوی الکتروفورزی پروتئینهای ذخیرهای بذر (SSPs) چهار رقم کلزا به ترتیب شامل: تاسیلو (T)، الایت (El)، زرفام (Z) و اکاپی (Oc) و M: نشانگر پروتئینی؛ (B آنالیز میزان بیان نسبی پروتئینهای ذخیرهای بذر چهار رقم کلزا. دادهها میانگین ۳ تکرار ±Std.
شکل 3- (A الگوی الکتروفورزی پروتئینهای برگهای لپهای چهار رقم کلزا به ترتیب شامل: تاسیلو (T)، الایت (El)، زرفام (Z) و اکاپی (Oc) و M: نشانگر پروتئینی؛ (B آنالیز میزان بیان نسبی پروتئینهای برگهای لپهای چهار رقم کلزا. دادهها میانگین ۳ تکرار Std ±.
بر اساس حضور و عدم حضور (غیاب) باندهای پروتئینی ویژهای شامل باندهای ۳، ۴ و ۵ در الگوی الکتروفورزی پروتئینهای ذخیرهای بذر روابط خویشاوندی چهار رقم منتخب کلزا در این مطالعه بررسی شد. این نتایج نشان داد که ارقام تاسیلو و الایت دارای بیشترین شباهت با یکدیگر بوده، رقم اکاپی کمترین شباهت را با سایر ارقام داشت. همچنین، ارقام تاسیلو و الایت بیشترین شباهت را با رقم زرفام داشتند (شکل ۴).
شکل 4- دندروگرام بررسی روابط خویشاوندی بر اساس باندهای پروتئینهای ذخیرهای بذر (SSPs) در بذر چهار رقم کلزا به ترتیب شامل: تاسیلو (T)، الایت (El)، زرفام (Z) و اکاپی (Oc). دادهها میانگین ۳ تکرار± Std.
بحث و نتیجهگیری
در این مطالعه، محتوای پروتئین محلول کل در بذر هیچ کدام از ارقام منتخب کلزا تفاوت معنیداری با یکدیگر نداشتند. نتایج این بررسی با نتایج به دست آمده از مطالعه محتوای پروتئین محلول کل در چهار رقم پسته ایرانی مشابه بود (Ehsanpour et al., 2010). اثر پذیری پروتئینهای موجود در بافتهای رویشی گیاهان (VSPs) از شرایط کشت و تغییرات محیطی احتمالاً میتواند یکی از دلایل متفاوت بودن محتوای پروتئین محلول کل برگهای لپهای بین ارقام مورد مطالعه کلزا در این تحقیق باشد.
پروتئینها، ترکیباتی ضروری در اغلب عملکردهای سلولی هستند. شناساگرهای پروتئینی به ویژه پروتئینهای ذخیرهای موجود در بذر گیاهان (SSPs) به دلیل عدم تأثیر پذیری از شرایط محیطی (Magni et al., 2007) و پایدارتر بودنشان نسبت به پروتئینهای موجود در بافتهای رویشی، ابزار و تکنولوژی معتبر و قدرتمندی در شناسایی ارقام و گونههای گیاهی معرفی شدند Jha and Ohri, 1996)؛ Javid et al., 2004؛ Iqbal et al., 2005؛ Seferoglua et al., 2006؛ Criley et al., 2008). بنابراین، پروفایل الکتروفورزی پروتئینهای ذخیرهای بذرها میتواند باندهای پروتئینی ویژهای را به صورت نشانگر مطرح نماید (Razavizadeh and Ehsanpour, 2013). بررسی تنوع ژنتیکی جمعیتهای گیاهی بر پایه نشانگرهای مولکولی مانند پروتئینها میتواند در برنامههای اصلاح نباتات نقش تعیینکنندهای داشته باشد. در مطالعه حاضر، عدم بیان ۳ باند پروتئینی در ژل مربوط به دانه شامل باندهای 67 (باند ۳)، 62 (باند ۴) در رقم اکاپی و 45 کیلو دالتونی (باند ۵) در ارقام تاسیلو و الایت و نیز سه باند پروتئینی در ژل مربوط به برگهای لپهای شامل باند 63 (باند ۲) در رقم اکاپی، ۵۱ (باند ۳) و ۲۲ کیلو دالتونی (باند ۵) در رقم الایت به عنوان نشانگرهای پروتئینی ارقام منتخب کلزا شناخته شد. به طور مشابه، در مطالعات قبلی، شناسایی واریتههای Ipomoea (Das and Mukherjee, 1995)، ارقام پسته ایرانی (Ehsanpour et al., 2010) و برخی ارقام سویا (Razavizadeh and Ehsanpour, 2013) بر پایه مطالعه الگوی پروتئینی SSPs صورت گرفته است. علاوه بر این، شناساگرهای پروتئینی SSPs به منظور بررسی روابط تاکسونومیک و تشخیص واریتههای کشت شده برخی گونههای گیاهان مهم زراعی مانند: blackgram Ghafoor et al., 2002)؛ Ghafoor and Ahmad, 2005)، Capsicum annuum L. (Anu and Peter, 2003)،Solanum(Menella et al., 1999)، Vigna spp. (Rao et al., 1992)، Arachis hypogaea (Javid et al., 2004)، wheat (Siddigui and Naz, 2009) و Vigna unguiculata (Win et al., 2011) نیز به کار گرفته شده است. بنابراین، این دسته از نشانگرهای مولکولی قابل به کارگیری در تشخیص و جداسازی ارقام مختلف Brassica نیز هستند.
نتایج حاصل از بررسی روابط خویشاوندی بر پایه حضور یا عدم حضور باندهای پروتئینی خاص در ژل مربوط به دانه نشان داد که ارقام تاسیلو و الایت بیشترین شباهت را با یکدیگر را داشتند. مشابه با مطالعه حاضر، حضور و غیاب باندهای پروتئینی در مطالعات پیشین نیز برای تشخیص تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی گونههای عدس (Ahmad et al., 1997) و ارقام پسته ایرانی (Ehsanpour et al., 2010) استفاده شده است.
سپاسگزاری
نویسندگان لازم میدانند ازحمایتهای دانشگاه پیام نور مرکز نجفآباد برای انجام این پژوهش قدردانی نمایند.