Phylogenetic systematics of Barn Owl (Tyto alba (Scopoli, 1769)) complex inferred from mitochondrial rDNA (16S rRNA) taxonomic implication

مقدمه

جغدها شامل دو خانواده Tytonidae و Strigidae هستند، که خانواده Tytonidae دارای دو جنس
1828) (Billberg Tyto (با 25 گونه) و Fhodiles (Geoffroy Saint-Hilaire, 1830) (با دو گونه) است. تمامی جغدهای جنس Tyto دارای صورت دیسکی قلبی‌شکل، چشمانی کوچک و سیاه و پاهای نسبتاً بلند هستند. شایان ذکر است که طول انگشتان داخلی و خارجی جغدهای جنس Tyto با طول انگشت وسطی آنها یکسان است (König et al., 2008). گونه جغد انباری با نام علمی Tyto alba (Scolopi, 1769)، بیشترین میزان پراکندگی را در میان سایر گونه‌های جنس Tytoدارد. Dickinson (2003) در فهرست پرندگان جهان برای جنس Tyto، 17 گونه و برای گونه T. alba، 32 زیرگونه در سرتاسر جهان تعریف کرده است. Wink و همکارانش (2004) توالی ژن میتوکندریایی CYTB (mitochondrial cytochrome b) و نشانگر هسته‌ای (intron LDHb-DNA) را برای 16 گونه از اعضای خانواده Tytonidae و 80 گونه از اعضای خانواده Strigidae مطالعه و بررسی کردند و در نهایت علاوه بر نشان دادن ارتباط بین گونه‌های این دو جنس بر مبنای اطلاعات مولکولی دو زیر گونه
T. f. delicatulaو T. f. sumbaensis را به مرتبه گونه ارتقاء دادند. Wink و همکارانش (2008) با بررسی ژن میتوکندریایی CYTB و ژن هسته‌ای RAG-1 (Recombination Activating Gene 1) برای نمونه‌هایی از گونه جغد انباری، زیرگونه T. f. bargei را به مرتبه گونه ارتقاء دادند. آنها واگرایی مولکولی قابل ملاحظه‌ای را بین نمونه‌های دنیای جدید و قدیم نشان دادند ولی شاخص بوت‌استرپ بالایی را برای این جدایی ارائه ندادند. König و همکارانش (2008) با استناد به مطالعه Wink و همکاران (2008) در دومین چاپ کتاب جغدهای جهان، زیرگونه T. f. insularisرا به عنوان گونه‌ای مجزا معرفی کردند. آنها برای جنس Tyto، 25 گونه و برای گونه T. alba، 15 زیرگونه در سرتاسر جهان تعریف کردند که از این تعداد 10 زیرگونه به دنیای قدیم و پنج زیرگونه به دنیای جدید متعلق است. Aliabadian و Nijman (2012) با استفاده از تعیین توالی ژن COX1 (mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1)، در بین زیرگونه‌های جغد انباری در نقاط متفاوت جهان واگرایی مولکولی را در بین زیرگونه‌های دنیای قدیم و جدید نشان دادند.

ژن 16s rRNA (16S Ribosomal RNA)، یکی از ژن‌های ساختاری و غیر کدینه میتوکندریایی است. این ژن به عنوان نشانگر مناسب برای رمزنگار مولکولی (DNA barcoding) در دوزیستان پیشنهاد شده است (Vences et al., 2000). البته به عنوان نشانگر مکمل برای رمزنگار مولکولی سایر گروه‌های جانوری در کنار سایر ژن‌های میتوکندریایی CYTB و COX1 به کار رفته است (Aliabadian and Nijman, 2012).

در این مطالعه، توالی ژن میتوکندری غیرکُدینه
16S rRNAبرای 40 نمونه از زیرگونه‌های جغد انباری بررسی شد. یافته‌های Wink و همکاران (2008) مبنی بر جدایی گونه جغد انباری دنیای جدید از دنیای قدیم و بررسی آنها به عنوان دو گونه مجزا مورد آزمون قرار گرفت و میزان واگرایی مولکولی بین گونه‌ای و درون‌گونه‌ای برای دو تبار دنیای قدیم و جدید تعیین گردید.

مواد و روش‌ها

نمونه‌گیری

تعداد 40 نمونه بافت ماهیچه‌ای، پَر و خون متعلق به 11 زیرگونه متفاوت از پنج ناحیه جغرافیایی جانوری اوراسیا، آفریقا، هندوچین، استرالیا، آمریکای شمالی و آمریکای جنوبی برای انجام کارهای مولکولی تهیه شد. از مجموع 7 زیرگونه متعلق به ناحیه جغرافیایی پالئارتیک، نمونه‌های T. a. alba،T. a. ernesti،
T. a. affinis و T. a. stertens و از دو زیرگونه متعلق به هندوچین، نمونه T. a. erlangeri و از پنج زیرگونه متعلق به آمریکا شمالی و جنوبی نمونه‌های
T. f. paratincula،T. f. tuidaraوT. f. hellmayeriو گونه‌هایT. bargei متعلق به جزیره کوراسائو واقع در خلیج مکزیک وT. delicatula متعلق به استرالیا بررسی شد. نمونه‌های بافت ماهیچه درون الکل خالص 96 درصد برای تثبیت طولانی مدت نگهداری شدند. زیر‌گونهNinox novaeseelandiae به عنوان برون گروه در درخت فیلوژنتیک مورد استفاده قرار گرفت. نمونه‌های بافت ماهیچه‌ای از موزه جانور‌شناسی یونان (Natural History Museum of Greece, NHMC)، موزه جانورشناسی آمستردام(Zoological Museum of Amsterdam, ZMA)، موزه جانورشناسی لوئیزیانا (Museum of Natural Science Louisiana State University, LSUMNSL) و موزه جانورشناسی دانشگاه فردوسی مشهد (Museum of Ferdowsi University of Mashhad, MFUM) تهیه گردید (جدول 1).

جدول 1- فهرست نمونه‌های بررسی شده

استخراج و تعیین توالی DNA

DNA ژنومی با قرار دادن نمونه‌ها در بافر استخراج (سدیم دو دسیل سولفات (SDS) 2 درصد و mg/ml10 پروتئیناز K در دمای 55 درجه سانتیگراد و با استفاده از روش استاندارد نمکی (salt method) استخراج شدند (Bruford et al., 1992). قطعه ژن میتوکندریایی
16S rRNA با استفاده از پرایمرهای جهانی:

16SA- L (5-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3)

و

16SB-H (5-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3)

تکثیر شد (Vences et al., 2000).

شرایط آماده‌سازی محلول PCR برای ژن 16S طبق روش Vences و همکاران (2000) فراهم شد. در این این روش، برای تکثیر منطقه مورد نظر از رژیم حرارتی: دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 90 ثانیه، 33 دور شامل دمای 94 درجه سانتیگراد 45 ثانیه (مرحله واسرشت شدن)، دمای 55 درجه سانتیگراد 45 ثانیه (مرحله اتصال پرایمر) و دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 90 ثانیه در (مرحله طویل شدن) و برای خالص‌سازی محصولات PCR از کیت Qia-quick PCR Purification (Qiagen) استفاده گردید.

ژن‌های تکثیر شده توسط دستگاه تعیین‌کننده توالی خودکار ABI prisma‌ مدل 3700 با پروتکل (روش پیش‌نویس) شرکت سازنده تعیین توالی گردیدند.

توالی ژن 16S با ارجاع به نقشه ساختاری ثانویه ژن (Gutell and Fox, 1988) و با استفاده از نرم‌افزار Sequence Navigator (1,0,1) هم‌تراز شد
(Kjer, 1995) و در انتها توالی به طول 569 نوکلئوتید برای هر تاکسون استفاده شد که در آن 310 نوکلئوتید برای ناحیه حلقه (Loop) و 258 نوکلئوتید برای ناحیه ساقه (Stem) تشخیص داده شد.

تحلیل داده‌ها

مقایسه فاصله مولکولی K2P داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار mega 5.1 (Tamura et al., 2011) و تحلیل‌های فیلوژنتیک، با محاسبه درخت‌های مولکولی میانبُرترین (Maximum Parsimony, MP)، محتمل‌ترین (Maximum Likelihood, ML) و بیزین (Baysian) برای توالی ژن 16S انجام شد. تحلیل‌های MP و ML برای تمامی داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار PAUP v.4.0b10 (Swofford, 2002) انجام گرفت. مدل تکاملی و شاخص‌هایش با استفاده از معیار آزمون نسبی سلسله مراتبی محتمل (Akaike information criterion, AIC) تعیین و در نرم‌افزار Modeltest (Posada and Crandall, 1998) اجرا گردید (Schmitz et al., 2005). مدل‌های تخمینی در رسم درخت ML با جابجایی شاخه‌ای TBR بر اساس جستجوی Heuristic و اضافه شدن درختی به صورت پله‌ای با 10 تکرار اضافی و تصادفی انجام شد. برای آزمون میزان صحت گره‌ها شاخص بوت‌استرپ 500 و 2000 به ترتیب برای تحلیل‌های MP وML استفاده شد.

تحلیل بیزین با استفاده از روش زنجیره مارکوف مونت کارلو (Markov Monte Carlo Chain) با نرم‌افزار MrBayes 3.1.1 انجام شد (Huelsenbeck and Ronquist, 2001). مطالعات قبلی نشان داده‌اند که ژن‌ها و نواحی متفاوت یک ژن می‌توانند تحت تأثیر مدل‌های تکاملی مختلف قرار گیرند و این خود بهترین دلیل برای استفاده از تحلیل‌های گروه‌بندی شده است. دو بخش P1 و P2 برای ژن 16S طراحی شد (P1: ژن 16S بدون هیچ گونه تقسیم‌بندی؛ P2: ژن 16S که به دو بخش ساقه و لوپ تقسیم شده است). این بخش‌ها با توجه به ساختار، محدودیت‌های تکاملی و بیوشیمیایی ژن مورد نظر در نظر گرفته شده‌اند. مدل‌های مناسب تکاملی برای هر بخش توسط AIC با استفاده از Modeltest انتخاب شدند (Schmtiz et al., 2005). برای انتخاب راهبرد گروه‌بندی مناسب که مجموعه داده‌ها را با حداقل اشتباه تصادفی توضیح دهد از عامل بیس (Bays) استفاده شد (Brandley et al., 2005).

عامل بیس بر اساس تفاوت لگاریتم میانگین هارمونیک احتمال پیش‌فرض اولیه در بین دو گروه انتخابی و ضرب عدد حاصله در دو تخمین زده شد (Brandley et al., 2005). میانگین هارمونیک در تحلیل بیزین و دستور sump قابل محاسبه است. عوامل بیس با استفاده از معیار 2ln ≥10 ارزیابی شد Huelsenbeck and Imennov, 2002)؛Lovette, 2003; Brandley et al., 2005). در فرآیند زنجیره مارکوف مونت کارلو، دو زنجیره به طور همزمان برای ده میلیون تکرار با پیش‌فرض قبلی انتخاب درخت در هر 1000 نسل (نتیجه 000/100 درخت) اجرا گردید. این تحلیل با انتخاب یک درخت به طور تصادفی شروع می‌شود. 5000 درخت اول برای حفظ سطح اطمینان نادیده گرفته و مقدار احتمال اولیه برای سایر درخت‌های باقی‌مانده محاسبه می‌شود. تنها توپولوژی‌هایی که با شاخص بوت‌استرپ بیش از 70 درصد در ML و MP و بیش از 95 درصد در روش بیزین حمایت شده و معتبر شناخته می‌شوند (Hillis et al., 1993).

نتایج

از 569 نوکلئوتید ژن 16S به کار رفته برای 41 نمونه، با احتساب توالی نمونه Ninox novaeseelandiae به عنوان برون گروه در تحلیل مولکولی، 297 متغیر تک ریخت و 74 متغیر چند ریخت بودند. از 48 متغیر متغیر یگانه (Singleton variable sites) تمامی آن دو متغیر بودند. تعداد هاپلوتیپ‌های به دست آمده برای گونه‌های Tyto با احتساب گروه خارجی 11 عدد بود. میانگین فاصله ژنتیکی درون گونه‌ای (Kimura-2-parameter) با نرم‌افزار Mega 5.1 (Tamura et al., 2007) برای گونه T. bargei 09/0 درصد، گونه T. furcata 5/0 درصد، گونه T. alba 79/1 درصد و گونه
T. delicatula5/0 درصد محاسبه شد. کمترین میزان واگرایی ژنتیکی درون گونه‌ای متعلق به گونه
T. bargei و بیشترین میزان واگرایی ژنتیکی متعلق به گونه T. alba است. فاصله ژنتیکی بین گونه‌های
T. alba و T. furcata 76/3 درصد، بین گونه‌های
T. albaو T. bargei 52/3 درصد، بین گونه‌های
T. delicatula و T. alba 32/4 درصد، بین گونه‌های
T. bargeiو T. Furcata 2/0 درصد، بین گونه‌های
T. bargei و T. delicatula 2/4 درصد و بین گونه‌های T. delicatula وT. furcata 22/4 درصد اندازه‌گیری شد (جدول 2). بیشترین میزان واگرایی ژنتیکی بین گونه‌ای مربوط به گونه‌های T. alba و T. delicatula و کمترین میزان آن مربوط به گونه‌های T. furcataو
T. Bargei است (جدول 3).

جدول 2- میانگین فاصله ژنتیکی بین گونه‌ای و درون گونه‌ای (Kimura-2-parameter) برای گونه‌های جنس Tyto

جدول 3- اطلاعات ژنتیکی مربوط به 4 گونه از جنس Tyto در جهان

تحلیل بیزین (Baysian)

این درخت دو تبار اصلی، یکی مربوط به آمریکای شمالی و کوراسائو T. furcata) و
(T. bargei و دیگری مربوط به آسیا و آفریقا و اروپا (T. alba) را با شاخص بوت‌استرپ 100 درصد از هم جدا می‌کند. گونه مربوط به استرالیا (T. delicatula) و زیرگونه متعلق به اندونزی
(T. a. stertens) با شاخص بوت‌استرپ 100 درصد به عنوان تاکسون‌های خواهری به طور مجزا در تبار T. furcata قرار گرفتند. نمونه‌های متعلق به گونه T. bargei در تبار مربوط به دنیای جدید (T. furcata) در کنار سایر زیرگونه‌های
T. furcata، T. f. hellmayeri و T. f. pratincola قرار گرفته‌اند (شکل 1).

تحلیل میانبُرترین درخت (Maximum Parsimony, MP)

تعداد متغیر‌های بهینه دارای اطلاعات، 26 عدد بوده که 18 متغیر آن دارای دو واریانت، هشت متغیر آن دارای سه واریانت است. میانبُرترین درخت توسط نرم‌افزار PAUP به دست آمد و در نهایت همراه با آزمون تأییدی شاخص بوت‌استرپ رسم گردید. در این درخت نیز دو تبار دنیای قدیم و جدید با شاخص بوت‌استرپ بالای100 درصد از هم دیگر جدا شدند. زیرگونه اندونزیایی (T. a. stertens) و گونه متعلق به استرالیا (T. delicatula) با شاخص بوت‌استرپ 100درصد به عنوان تاکسون‌های خواهری در تبار
T. furcata قرار می‌گیرند. در این درخت هم گونه
T. bargei در تبار furcata قرار گرفته و واگرایی ژنتیکی اندکی را نسبت به سایر زیرگونه‌های این تبار نشان می‌دهد (شکل 1).

تحلیل محتمل‌ترین درخت (Maximum Likelihood, ML)

تحلیل ML با استفاده از نرم‌افزار PAUP انجام شد. ابتدا 56 مدل تکاملی برای توالی‌ها بررسی شد که در نهایت بر اساس معیار AIC (Akaike Information Criterion) مدل TVM+I+G انتخاب شد. نسبت متغیر‌های نامتغیر به کل متغیر‌ها برابر 5817/0 و نسبت متغیر‌های فاقد تغییر (شاخص شکل توزیع گاما) برابر با 6663/0 است. فرکانس نوکلئوتید آدنین 3098/0، گوانین 2130/0، سیتوزین 2682/0 و تیمین 2089/0 محاسبه شد. درخت ML با شاخص بوت‌استرپ 500 مرتبه تکرار بر اساس مدل TVM+I+G رسم گردید. نتایج به دست آمده از درخت ML با نتایج به دست آمده از درخت MP همخوانی کامل داشت. مشابه دو درخت قبلی دو تبار اصلی وجود دارد. در این درخت دو تبار T. alba متعلق به دنیای قدیم و T. furcata متعلق به دنیای جدید با شاخص بوت‌استرپ 90 درصد از هم جدا شده‌اند. نمونه‌های متعلق به اندونزی با شاخص بوت‌استرپ 99 درصد همراه با نمونه‌های متعلق به استرالیا در تبار جداگانه‌ای قرار گرفته‌اند که این تبار با تبار T. furcata همراه شده است. گونه
T. bargeiدر تبار T. furcata در کنار زیرگونه‌های
T. f. hellmayri و T. f. pratincolaقرار گرفته است (شکل 1).

بحث

تمامی درخت‌های ترسیم شده در این مطالعه مؤید وجود دو تبار اصلی بین گونه‌ای جغد انباری پراکنده شده در دنیای قدیم و جدید هستند. در تمامی درخت‌ها این دو تبار اصلی با شاخص بوت‌استرپ بالای 90 درصد از یکدیگر جدا می‌شوند (شکل 1).

DNA میتوکندری بارها برای مطالعه و بازبینی روابط فیلوژنتیک در گروه‌های متفاوت جانوری استفاده شده است. ژن‌های میتوکندریایی به مراتب سریع‌تر از ژن‌های هسته‌ای تکامل می‌یابند. در نتیجه توانایی بیشتری برای نشان دادن تفاوت‌های موجود در بین تاکسون‌های نزدیک را دارند. معمولاً از این ژن‌ها برای نشان دادن واگرایی بین جمعیت‌هایی که برای دوره زمانی نسبتاً کوتاهی از یکدیگر جدا شده‌اند، استفاده می‌شود.

میزان واگرایی ژنتیکی بین گونه‌های متفاوت، به مراتب از واگرایی ژنتیکی درون گونه‌ای بیشتر است. در واقع، نتایج به دست آمده از بررسی و مقایسه mtDNA در گونه‌های متفاوت، بیانگر فواصل آرایه‌شناختی است که توسط آرایه‌شناسان به عنوان گونه شناسایی می‌شود (Hebert et al., 2004).

شکل 1- درخت حاصل از تحلیل میانبُرترین درخت (MP) به همراه مقادیر شاخص بوت‌استرپ سه تحلیل مربوط به میانبُرترین درخت (MP)، محتمل‌ترین درخت (ML) و بیزین (Baysian)