Document Type : Original Article
Authors
Department of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences and Health Services, Isfahan, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
مقدمه
بیش از 280 گونه از جنس Crataegus (Ching-Yeeet al., 2010) در سراسر جهان، شامل اروپا، خاور میانه، آسیای جنوب شرقی و آمریکای شمالی وجود دارد (Raul et al., 2009). این جنس در ایران دارای پراکندگی زیادی است و 17 گونه آن در ایران وجود دارد (مظفریان، 1375). گیاه زالزالک گرجی با نام علمی Crataegus pontica C. Koch گونه‌ای متعلق به این جنس است (Ozcan et al., 2005). از گیاهان این جنس به طور وسیع در طب سنتی و گیاه درمانی کشورهای اروپایی برای درمان برخی از بیماری های قلبی-عروقی استفاده می‌شود (فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛ (Xiao-Ping et al., 2010. آثار درمانی گونه‌های زالزالک به خاطر ترکیبات پلی‌فنلیک موجود در آن است (Xiao-Ping et al., 2010). عصاره این گیاه غنی از فلاونوئید و اسیدهای هیدروکسی سینامیک است (Predrag et al., 2005). بیشتر محصولات حاصل از برگ و گل این گیاه بر اساس فلاونوئید تام آن استاندارد شده‌اند (Wieland et al., 2008). نوع، میزان و درصد فلاونوئیدها نشانه کیفیت گیاه است (Urbonaviciute et al., 2006). کلمه فلاونوئید از واژه لاتین فلاوس به معنای زرد رنگ مشتق شده است (Goodwin, 1976)، تا کنون بیش از هزاران ترکیب از دسته فلاونوئیدها از گیاهان مختلف شناسایی و استخراج شده است (Craker and Simon, 1992). آثار بیولوژیک متعددی را در گیاهان به فلاونوئیدها نسبت می‌دهند. این ترکیبات نقش دفاع در برابر پاتوژن‌های گیاهی (Street and Cockburn, 1972)، تأثیرگذار در متابولیسم کربوهیدرات‌ها و همچنین، نقش احتمالی در فتوسنتز را دارا هستند (Goodwin, 1976; Harborne et al., 1976).
الگوی کیفی و کمّی فلاونوئیدها به طور مشخص در شناسایی سیستماتیک شیمیایی استفاده می‌شود (Husain et al., 1982; Ringl et al., 2007). این ترکیبات به طور گسترده‌ای نسبت به سایر ترکیبات ثانویه در گیاهان پراکندگی دارند، در نتیجه استفاده از آنها به عنوان مارکر در مطالعات سیستماتیک شیمیایی محدود نیست. علاوه بر این، به نظر می‌رسد فلاونوئیدها جزو پایدارترین مواد مؤثره گیاهی باشند و همچنین تغییرات کیفی آنها در سطح گونه‌ها بسیار محدود است. همچنین، این ترکیبات معمولاً به راحتی شناسایی می‌شوند (Lai Fang et al., 2001). با توجه به موارد فوق، فلاونوئیدها بیش از همه ترکیبات ثانویه گیاهی در مطالعات تاکسونومی استفاده می‌شوند (Svehlikova et al., 2002; Albach et al., 2005;Husain et al., 1982).
زالزالک گرجی با نام علمی C. pontica C. Koch درختی است با ارتفاع 6 تا 10 متر که دارای ساقه باریک و محکم با پوست قهوه‌ای مایل به خاکستری و دارای شکاف‌های عمیق طولی است و برگ‌های آن تخم‌مرغی-بادبزنی شکل است، دمبرگ آن کوتاه و گل آن سفید و میوه آن تقریباً کروی و به رنگ زرد طلایی (قهرمان، 1376) و نارنجی (Donmez, 2005, 2009) است. انتشار این گونه از ارمنستان و قفقاز و ایران تا ترکیه پیش می‌رود (ثابتی، 1373) و پراکندگی آن شامل قسمت‌های شمال غرب و غرب و مرکز ایران است (خاتمساز، 1371).
در این تحقیق به بررسی ریخت‌شناسی و فیتوشیمیایی مقدماتی گیاه پرداخته شد، سپس با بررسی کیفی و کمّی فلاونوییدها و اسیدهای هیدروکسی سینامیک موجود در آن به بررسی رابطه‌های سیستماتیک شیمیایی آن با گونه‌های C. monogyna Jacq.،C. melanocarpa M. Bieb.وC. curvisepala Lind. که در ایران موجود هستند و همچنین، گونه استاندارد دارویی آن یعنی
C. oxyacantha L. که در بیشتر نقاط دنیا از آن به عنوان داروی اصلی این جنس گیاهی استفاده می‌شود؛ پرداخته شد.
مواد و روش‌ها
جمع‌آوری گیاه: اندام‌های مختلف دارویی گیاه C. ponticaاز شهرستان ایوان غرب، در اردیبهشت و شهریورماه 1389 و 1390 جمع‌آوری شد. این شهر دارای طول جغرافیایی 46 و 17 دقیقه و عرض جغرافیایی 33 درجه و 49 دقیقه است، که در شمال غرب استان ایلام واقع شده و متوسط ارتفاع آن از سطح دریا 1170 است. منطقه ایوان غرب، منطقه‌ای از حوزه زاگرس با چین‌خوردگی‌های وسیع است (نوری، 1379). شناسایی سیستماتیک گیاه در دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی کرمانشاه انجام پذیرفت.
خشک کردن نمونه‌ها: گیاهان پس از جمع‌آوری در سایه و در معرض جریان هوا خشک شدند. اندام‌های مختلف گیاهی شامل گل، برگ و میوه به قطعات کوچکتر تقسیم شده، پس از خشک شدن در محل خنک قرار گرفته تا از فساد و پوسیدگی آنها جلوگیری شود (عسگری، 1378؛ صمصام شریعت، 1372).
بررسی ماکروسکوپی: در بررسی‌های ماکروسکوپی، ویژگی‌های ظاهری گل، برگ و میوه گیاه C. ponticaمشخص و با گیاه C. oxyacantha مقایسه شد، سپس نمونه‌ها برای خشک کردن آماده شدند (Ghassemi Dehkordi et al., 1996).
شناسایی میکروسکوپی: به منظور انجام آزمایشهای میکروسکوپی و خرده‌نگاری، پودر گل و برگ گیاهان مورد مطالعه، توسط روش‌های میکروسکوپی معمول و با استفاده از محلول کلرال هیدراته بررسی شد (Ghassemi Dehkordi et al., 1996; Eschrich, 1986).
آزمایشهای فیتوشیمیایی: با توجه به وجود فلاونوئیدها و اسیدهای هیدروکسی سینامیک به عنوان اصلی‌ترین مواد متشکله گیاه، بررسی دقیق‌تر، شامل شناسایی و تعیین کمّی بر روی این دسته از مواد گیاه صورت گرفت.
عصاره‌گیری: پودر اندام‌های مختلف در دمای 60 درجه سانتیگراد مخلوط و در داخل یک ارلن عصاره‌گیری و سپس صاف گردید (Wagner et al., 1999).
کروماتوگرافی لایه نازک (TLC): با بهره‌گیری از روش کروماتوگرافی لایه نازک و استفاده از فاز ثابت سیلیکاژل 60G و فاز متحرک اتیل استات- فرمیک‌اسید-اسید استیک گلاسیال-آب (100-11-11-27) اقدام به کاشت عصاره حاصله از مرحله قبل بر روی صفحات شد. پس از گسترش حلال بر روی صفحات از معرف Natural product/Polyethylenglycol 4000 برای ظهور لکه‌های فلاونوئیدی موجود در گیاه استفاده شد (Wagner et al., 1999).
تعیین کمّی فلاونوئیدها (فلاونول‌ها) بر اساس هیپروزید: با استناد به وجود فلاونول گلیکوزیدها در گونه‌های گیاه زالزالک گرجی (Wagner, 1988; Wichtl, 1989) و با استفاده از روش مندرج در فارماکوپه گیاهی ایران، درصد فلاونوئیدهای قسمت‌های مختلف گیاه اندازه‌گیری شد (احمدی، 1374؛ فارماکوپه گیاهی ایران، 1381؛Ghassemi Dehkordi and Ghannadi, 1993) هر تعیین مقدار سه مرتبه تکرار گردید.
2/0 گرم از اندام مورد نظر گیاه را در بالن ریخته، مخلوطی از 1 میلی‌لیتر متنامین یا هگزامتیلن تتراآمین 5/0درصد در آب، 20 میلی‌لیتر استون و 2 میلی‌لیتر اسید کلریدریک 25 درصد به آن افزوده شد و پس از رفلاکس به مدت نیم ساعت، صاف شده و در یک بالن ژوژه 100 میلی‌لیتری ریخته و مجدداً پودر در دو مرحله و هر بار ده دقیقه با 20 میلی‌لیتر استون رفلاکس و به مخلوط قبلی اضافه گردید و نهایتاً با استون به حجم رسانده شد. به 20 میلی‌لیتر از این محلول، مخلوطی از 20 میلی‌لیتر آب و 15 میلی‌لیتر اتیل استات اضافه شد و پس از به هم زدن، فاز اتیل استانی به یک ارلن 50 میلی‌لیتر منتقل گردید. فاز آب و استون نیز در سه مرحله و هر بار با 10 میلی لیتر اتیل استات استخراج شد و فازهای اتیل استاتی به اتیل استات قبلی افزوده گردید.
مجموعه فازهای اتیل استاتی، دوبار و هر مرتبه با 50 میلی لیتر آب مخلوط و تکان داده شده (دکانته)، در نهایت در یک بالن 50 میلی‌لیتری به حجم رسانده شد. به 10 میلی‌لیتر از این محلول، 1 میلی‌لیتر از محلول 2 درصد کلرور آلومینیوم در استیک اسید 5 درصد در متانول افزوده گردید و در یک بالن ژوژه 25 میلی‌لیتری به حجم رسانده شد. جذب محلول حاصله پس از نیم ساعت در طول موج 425 نانومتر در مقابل محلول شاهد اندازه‌گیری و با استفاده از فرمول تجربی (1)، درصد فلاونول‌ها بر اساس هیپروزید محاسبه گردید. برای تهیه محلول شاهد، 10 میلی‌لیتر از محلول نمونه اتیل استاتی در بالن ژوژه 25 میلی‌لیتری ریخته و با محلول 5 درصد استیک اسید در متانول به حجم رسانده شد. جذب محلول یک درصد از هیپروزید معادل 500 در نظر گرفته شد. جذب محلول یک درصد از هیپروزید معادل 500 در نظر گرفته شد و از این فرمول تجربی برای محاسبه فلاونول ها در گیاه استفاده گردید.
فرمول تجربی (1):
= درصد فلاونول‌ها بر اساس هیپروزید
نتایج
نتایج ماکروسکوپی: نتایج حاصل از بررسی ماکروسکوپی در جدول شماره 1 گزارش شده است.
نتایج میکروسکوپی: نتایج حاصل از این بررسی در شکل شماره 1 آورده شده است.
نتایج حاصل از کروماتوگرافی لایه نازک عصاره: طبق روش ارائه شده در قسمت مواد و روش‌ها، پس از انجام کروماتوگرافی وجود لکه‌هایی با Rf معادل 35/0، 45/0 و 55/0 در مخلوط گل و برگ
C. oxyacanthaو C. pontica اثبات شد که با توجه به رنگ لکه در طول موج 365 نانومتر و مقایسه Rf و رنگ حاصله با استانداردهای موجود، این لکه‌ها به ترتیب مربوط به روتین، کلروژنیک اسید و هیپروزید است (Wagner et al., 1999).
نتایج حاصل از تعیین کمّی فلاونول‌های گیاهی: نتیجه حاصل از اندازه‌گیری میزان فلاونوییدها طبق روش کار در جدول 2 ارائه شده است.
جدول 1- ویژگی‌های ظاهری گیاهان C. ponticaوC. oxyacantha
|
نام گیاه |
C. pontica |
|
برگ |
بادبزنی تا تخم‌مرغی، به طول3 تا 6 و عرض 2/5 تا 6/5 سانتی‌متر، دارای 5 لوب عمیق، دمبرگ کوتاه، با سطح پشتی کرکینه پوش |
|
گل |
گل سفید، مجتمع در گل‌آذین‌های حامل تا 14گل، کاسبرگ‌ها مثلثی، گلبرگ‌ها تخم‌مرغی تا تقریباً مدور، دارای 2 خامه و به ندرت 3 تا |
|
میوه |
تقریباً کروی، به قطر 12 تا 18 میلی‌متر، به رنگ زرد طلایی و نارنجی و خوراکی، دارای 2-3 دانه |
|
نام گیاه |
C. oxycantha |
|
برگ |
واژ تخم‌مرغی تا تخم‌مرغی پهن، به طول3 تا 7 سانتی‌متر و دارای 3 تا 7 لوب، دمبرگ 1 تا 3 سانتی‌متر و کوتاه، با سطح پشتی کرکینه پوش |
|
گل |
گل سفید و صورتی، گل‌آذین‌های دیهیمی حامل تا گل زیاد، گل به قطر 12 تا 17 میلی‌متر، دارای 1 تا 3 خامه |
|
میوه |
تقریباً کروی، به قطر 10 میلی‌متر و به رنگ قرمز روشن تا ارغوانی تیره و خوراکی، دارای 1-3 دانه |
شکل 1- خرده‌نگاری پودر اندام هوایی گیاه C. pontica. (1 از برگ در نمای عرضی با تریکوم غیر ترشحی نوک تیز؛ (2 اپیدرم برگ در نمای سطحی با شکل موّاج همراه با کریستال‌های اگزالات کلسیم؛ (3 اپیدرم برگ همراه با با روزنه های هوایی آنموسیتیک؛ (4 گرده‌های گل سه گوش با سطح خارجی پرزی، از نوع tricolpat؛ (5 بافت اپیدرم گلبرگ؛ (6 تریکوم‌های غیرترشحی، خمیده و کِرِم رنگ؛ (7 ذرات کریستال مکعبی به صورت منفرد؛ (8 بافت اندوتسیوم که در محلول کلرال هیدراته سرد قرمز رنگ است.
جدول 2-درصد فلاونول‌ها در گیاهان مورد بررسی
|
نمونه |
درصد فلاونول بر اساس هیپروزید |
|
مخلوط گل و برگ C. oxyacantha |
08/0±67/0 |
|
مخلوط گل و برگ C. pontica |
10/0±81/0 |
|
گل C. pontica |
05/0±34/0 |
|
برگ C. pontica |
10/0±95/0 |
|
میوه C. pontica |
03/0±15/0 |
بحث
امروزه علی‌رغم پیشرفت علمی بشر و دستیابی او به داروهای جدید و با تأثیر سریع‌تر، نه تنها توجه به گیاهان دارویی کمتر نشده، بلکه روز به روز بیشتر هم شده است (اصغری، 1385). نزدیک به 300 گونه از جنس زالزالک در دنیا شناخته شده است که از نظر زیستی فعال هستند و می‌توانند در علوم مختلف استفاده و بهره‌برداری شوند.
از فرآورده‌های دارویی گیاه زالزالک عمدتاً در درمان بیماری‌های قلبی استفاده می‌شود. خواص آنتی‌اکسیدانت (Xiao-Ping et al., 2010; Ching-Yee et al., 2010)، ضد التهاب و ضد سرطان (Erl-Shyh et al., 2007)، کاهنده قند خون (Alarcon-Aguilara et al., 1998) و کاهنده کلسترول خون در مدل‌های حیوانی (Wieland et al., 2008) برای آن گزارش شده است.
تأثیرات درمانی زالزاک، به ویژه به واسطه وجود ترکیبات پلی فنلیک موجود در آن است (Xiao-Ping, 2010). فلاونوئیدها به طور وسیعی در سیستماتیک گیاهی نیز به کار گرفته شده‌اند (جود و همکاران، 1386؛ (Husain et al., 1982. سیستماتیک شیمیایی یا کموسیستماتیک علم کاربرد و استفاده از اطلاعات ترکیبات شیمیایی موجود در گیاه در مسائل مختلف سیستماتیک گیاهی است (جونز و لوچ سینگر، 1369). مواد شیمیایی به طور وسیعی در سیستماتیک گیاهی از تحلیل تنوعات فروگونه‌ای گرفته تا تعیین روابط تبارشناختی خانواده‌ها و گروه‌های تاکسونومیک بالاتر استفاده می‌شوند (جود و همکاران، 1386). پلی‌فنل‌ها در میان مارکرهای شیمیایی موجود در گیاهان، گسترده‌ترین استفاده را در مطالعات سیستماتیک شیمیایی دارند. در میان گروه‌های مختلف فنلی، فلاونوئیدها ترکیباتی هستند که با بیشترین موفقیت به کار رفته و شاید مفیدترین دسته از ترکیبات ثانویه گیاهی از دیدگاه سیستماتیک باشند. در طول 30 سال گذشته، مشخص شده است که فلاونوئیدها می‌توانند در تمام سطوح تاکسونومی تعیین‌کننده باشند و حتی اثبات شده است که می‌توانند در تشخیص هیبریدهای گیاهی به‌کار روند.
مزیت فلاونوئیدها نسبت به ترکیبات ثانویه دیگر، این است که این ترکیبات تغییرات ساختاری را نشان می‌دهند و آنها را می‌توان به چندین نوع تقسیم کرد. همچنین توزیع گسترده آنها در گیاهان، باعث عدم محدودیت استفاده از آنها به عنوان مارکر در مطالعات سیستماتیک می‌شود. پایداری شیمیایی و شناسایی راحت و سریع از مزایای دیگر فلاونوئیدهاست و همچنین، تغییرات کیفی آنها در سطح گونه ها بسیار محدود است (Lai Fang et al., 2001).
این شرایط سبب شده است این ترکیبات با موفقیت در مطالعات تاکسونومی در جنس‌های مختلف استفاده شوند. نمونه‌هایی از این جنس‌ها عبارتند از:
Crataegus(Sinnott and Phipps, 1983)،Potentilla(Asker and Frost, 1970)، Rubus(Bammi and Olmo, 1966)،Hierochloe(Weimarck, 1970)،Trichosonrhes(Masao et al., 1987)و گونه‌هایی از سرخس‌ها (Haufler and Giannasi, 1982).
در مطالعه حاضر با بررسی کیفی فلاونوئیدهای موجود در گونه C. pontica به روش TLC مشخص شد که این گونه احتمالاً حاوی فلاونوئیدهای هیپروزید، روتین و کلروژنیک اسید است که به صورت لکه‌هایی با Rf معادل 35/0 (روتین)، 45/0 (کلروژنیک اسید) و 55/0 ( هیپروزید) روی صفحه سیلیکاژل در بررسی عصاره‌های گیاه ظاهر شدند.
گونه‌های C. monogynaوC. melanocarpa(محسنی‌فرد، 1374) وC. curvisepala (محتاج، 1374) نمونه‌های دیگری از جنس زالزالک هستند که در ایران موجود بوده و قبلاً مورد مطالعاتی مشابه قرار گرفته‌اند. در این مطالعات، فلاونوئیدهای این گونه‌ها از نظر کیفی و کمّی بررسی شده‌اند. با مقایسه‌ای که بین نتایج حاصل ازاین گونه و گونه‌های نامبرده و نیز گونه استاندارد دارویی گیاه یعنی C. oxyacantha صورت گرفت، مشخص شد که در همه این گونه‌ها، هیپروزید، روتین و کلروژنیک اسید به عنوان فلاونوئیدها و هیدروکسی سینامیک اسید شاخص موجود هستند.
در بررسی ماکروسکوپی و میکروسکوپی اندام‌های گیاه، مشخص شد که برخی از این خصوصیات با آنچه در منابع در مورد سایر گونه‌های گیاه ذکر شده است، یکسان است. نتایج ریخت‌شناسی گیاه نیز تشابهاتی را با سایر گونه ها نشان داد (قهرمان،1376؛ عبدالی، 1389؛ (Donmez, 2005, 2009. تفاوت‌های بارزی که در مقایسه با گونه استاندارد دارویی گیاه؛ یعنی
C. oxyacantha مشاهده شد، شامل شکل برگ وعمیق‌تر بودن لوب‌های آن در C. pontica بود. همچنین، دمبرگ‌ها در این گونه نسبت به گونه استاندارد کوتاه‌تر است. گل‌آذین در این گونه متراکم‌تر و رنگ گل‌ها متفاوت بود. گونه زالزالک گرجی دارای میوه‌های کم رنگ و تعداد دانه‌های میوه آن بیشتر بود.
در خرده‌نگاری اندام هوایی C. pontica، اپیدرم برگ با روزنه‌های هوایی و گاهی سلول های حاوی کریستال‌های اگزالات کلسیم مشاهده شد. گرده های گل نیز از نوع tricolpat به تعداد زیاد موجود بودند.
تریکوم‌های غیرترشحی در شکل‌های خمیده و کِرِم‌رنگ، به تعداد فراوان مشاهده شدند. قطعاتی از بافت اندوتسیوم که در محلول کلرال هیدراته سرد قرمز‌رنگ بودند نیز دیده شد. بسیاری از خصوصیات میکروسکوپی یاد شده در سایر گونه‌های زالزالک نیز دیده شده است.
به نظر می‌رسد بتوان از فلاونویید‌های هیپروزید و روتین و نیز کلروژنیک اسید در مطالعات آتی سیستماتیک شیمیایی جنس زالزالک یا حتی سایر جنس های گیاهی گیاهان متعلق به خانواده گلسرخیان استفاده نمود، خصوصاً با توجه به این نکته که این سه ترکیب در چندین جنس گیاهی دیگر از زالزالک نیز موجود بوده‌اند (محتاج، 1374؛ محسنی‌فرد، 1374؛ (Sinnott and Phipps, 1983.
تشکر و قدردانی
از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان برای تأمین هزینه این طرح تحقیقاتی به شماره 389368 تشکر و قدردانی می‌گردد. همچنین، از آقای دکتر سید محمد معصومی (دانشکده کشاورزی دانشگاه رازی کرمانشاه) جهت شناسایی گیاه مورد بررسی در این تحقیق سپاسگزاری می‌شود.
)