Document Type : Original Article
Authors
1 Faculty of Energy Engineering and New Technologies, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran
2 Faculty of Biological Sciences, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran
3 Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
4 Research Institutes of Forests and Rangelands, Tehran, Iran
Abstract
Keywords
Main Subjects
مقدمه
جنس گون (Astragalus L.) متعلق به تیره باقلائیان (Fabaceae)، در میان گیاهان گل‌دار از بزرگترین جنس‌هاست که در جهان بیش از 250 بخش (section) و حدود 3000 گونه دارد (Lock and Simpson, 1991, Podlech, 1998).
از میان تمام گونه‌های گون، حدود 2400 گونه آن انحصاراً در قاره آسیا پراکنش دارند. پیرامون تنوع گونهای در این جنس، مقالات و چک لیست‌های متعددی چاپ شده است (Lock and Simpson, 1991; Maassoumi, 1998; Podlech, 1986; Yakovlev et al., 1996). ایران با داشتن 804 گونه، که از میان آنها 527 گونه انحصاری کشور است، به عنوان یکی از مراکز گونه‌زایی گون در نظر گرفته می‌شود (Maassoumi, 2005). نخستین نظام رده‌بندی گون‌ها، در اوایل قرن نوزدهم و توسط دوکاندول، در سطح واحدهای فوق گونه‌ایِ مترادف با بخش، پایه‌ریزی گردید. Bunge (1868-1869) پس از جمع‌آوری‌های فراوان از ایران، برای نخستین بار در سال 1868 چارچوب طبقه‌بندی گون‌ها را بنیاد نهاد و با چاپ نخستین اثر خود، طبقه‌بندی جنس Astragalus با 10 زیرجنس و حدود 150 بخش را ارائه کرد و سپس به شرح گونه‌های جدید و پراکندگی آنها اقدام نمود. Gontscharov با پذیرفتن 9 زیرجنس Bunge، فلور شوروی را از نظر گون‌ها، بازنگری کرد (Gontscharov et al., 1946). Podlech (1982) بر اساس یک‌ساله یا چندساله بودن گونه‌ها و همچنین، نوع کرک‌پوش، تنها دو زیرجنس را برای Astragalusهای دنیای قدیم تشخیص داد. سپس Maassoumi (1998) با قبول 8 مورد از زیرجنس‌های معرفی شده به وسیله Bunge، اعضای دو زیرجنس Caprinus Bunge و Pogonophace Bunge را به درون دیگر زیرجنس‌ها منتقل کرد. در مطالعات مولکولی جامعی که در سال‌های اخیر روی تاکسون‌های متعددی از Astragalus انجام شد، مشخص گردید که هیچ‌کدام از این زیرجنس‌ها، گروه‌های تک‌تبار نیستند (Wojciechowski et al., 1999; Kazempour Osaloo et al., 2003, 2005). بنابراین، Maassoumi (2003) هنگام بازنگری گون‌ها برای فلور ایران، هیچ‌یک از این زیرجنس‌ها را نپذیرفت و اقدام به طبقه‌بندی و معرفی گون‌ها در سطح بخش نمود. تنها مطالعات مولکولی جامعی که در ایران بر روی بخش‌های وسیعی از Astragalus با استفاده از توالی‌های nrDNA ITS انجام شد، تنها 6 بخش تک‌تبار را مشخص نمودند و روابط میان سایر بخش‌ها، به صورت حل نشده باقی ماند (Kazempour Osaloo et al., 2003, 2005).
بر اساس نتایج حاصل از این مطالعات، نماینده‌های انتخاب شده از بخش‌های Ornithopodium، Onobrychoidei و Dissitiflori به همراه تاکسون‌هایی از دیگر بخش‌های کرک دوشاخه‌ای، درون یک تبار بزرگ پلی‌تومیک با روابط حل نشده، قرار می‌گیرند. با توجه به بزرگی جنس Astragalus از جهت تعداد گونه و بخش در ایران، بررسی فیلوژنی کلیه بخش‌ها در یک یا چند مطالعه محدود، ناممکن بوده، به نظر می‌رسد این مهم، طی مطالعات فیلوژنتیک متعدد یک یا چند بخش نزدیک به هم، با استفاده از صفات مختلف ریخت‌شناختی و به ویژه مولکولی، تحقق یابد. در تحقیق حاضر، کوشش شده است تا موقعیت فیلوژنتیک بخش Ornithopodium از جنس گون و همچنین، روابط تبارشناختی میان این بخش و بخش‌های نزدیک به آن با استفاده از اطلاعات حاصل از صفات ریخت‌شناختی و داده‌های مربوط به بخش‌هایی از ژنوم هسته‌ای و کلروپلاستی ارزیابی شود.
مواد و روش‌ها
مطالعات ریخت‌شناسی
نمونه‌های گیاهی جمع‌آوری شده و همچنین، نمونه‌های موجود در هرباریوم دانشگاه شهید بهشتی (SBUH) و هرباریوم مرکزی ایران (TARI) واقع در مؤسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع، برای مطالعات ریخت‌شناختی و مولکولی استفاده شدند. در مجموع 15 گونه به عنوان درون‌گروه و همچنین دو گونه نیز بر اساس مطالعات مولکولی پیشین (Kazempour Osaloo et al., 2003, 2005) به عنوان برون‌گروهوارد مطالعه شدند (جدول 1). بر اساس منابع موجود و مطالعات انجام شده روی نمونه‌های بخش‌های مذکور، صفات متعددی انتخاب، و حالت‌های مختلف آنها برای گونه‌ها، یادداشت شدند. سپس، حالات مختلف این صفات بر اساس ارزش‌گذاری‌های عددی و به صورت نامرتب (unordered) که در آن، تغییر از حالتی به حالت دیگر صفت یک گام محسوب می‌شود، کددهی شدند. کددهی به حالات مختلف صفات ریخت‌شناختی، با استفاده از روش gap-coding انجام پذیرفت (Tiele, 1993) و تلاش شد تا این صفات به صورت گسسته بوده، محدوده حالات تعریف شده صفات با یکدیگر هم‌پوشانی نداشته باشند. مجموعاً 26 صفت ریخت‌شناختی در این تحقیق استفاده شد که مشخصات این صفات به همراه حالات و کدهای مربوطه در جدول 2 ارائه شده‌اند. شایان ذکر است که ارزش‌های داده شده به حالات مختلف صفات، هیچ گونه برتری نسبت به یکدیگر نداشته، صفات و حالات مختلف دارای ارزش یکسان بودند. برای تعیین قطبیت صفات از روش به‌کا‌رگیری برون‌گروه (Maddison et al., 1984) استفاده شد. کلیه صفات وارد شده، از نظر بیشینۀ صرفه‌جویی، حاوی اطلاعات(parsimony informative) هستند. در نهایت، ماتریس عددی حاصل از داده‌های ریخت‌شناختی، در آنالیز تبارشناختی استفاده شد که در جدول 3 ارائه شده است.
مطالعات مولکولی
در تحقیق حاضر، تعدادی از گونه‌های مربوط به دو بخش Dissitiflori و Onobrychoidei به همراه 7 گونه از بخش Ornithopodium مطالعه شدند تا روابط فیلوژنتیک میان آنها بررسی شده، در ارتباط با جایگاه تاکسونومیک آنها اظهار نظر دقیق‌تری انجام پذیرد.
استخراج DNA، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و توالی‌یابی
DNA کل ژنوم از برگ‌های خشک شده نمونه‌های هرباریومی استخراج شد. روش استخراج بر مبنای روش C TAB (Doyle and Doyle, 1987) همراه با اندکی تغییر است. در این تحقیق، از توالی ناحیه nrDNA ITS ژنوم هسته‌ای و توالی ژن matK کلروپلاستی برای ارزیابی فیلوژنتیک تاکسون‌های مطالعه شده، استفاده شد. به منظور انجام واکنش PCR برای توالی هسته‌ای nrDNA ITS از آغازگرهای (پرایمر) ITS5m و ITS4 (White et al., 1990) یا آغازگرهای AB101F و AB102R (Douzery et al., 1999) استفاده شد. همچنین، برای تکثیر ژن matK از آغازگرهای trnk-F و matk-R (Ooi et al., 1995) استفاده گردید. توالی آغازگرهای مورد استفاده در جدول 4 ارائه شده است. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از برنامه بهینه شده با آغازگر مورد نظر و دستگاه‌های ترموسایکلر (Eppendorf, Germany; Astec, Japan) دارای 96 چاهک انجام شد. برنامه PCR پس از بهینه‌سازی شرایط واکنش، بدین شرح است: برای تکثیر قطعۀ ITS: واسرشتگی اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 150 ثانیه؛ 27 چرخه واکنش PCR (واسرشتگی در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه؛ اتصال آغازگرها در دمای 53 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، بسط اولیه در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 50 ثانیه)؛ و در پایان بسط نهایی در 72 درجه سانتیگراد به مدت 7 دقیقه انجام شد. تکثیر ناحیه matK نیز مشابه ITS بود؛ با این تفاوت که تعداد چرخه‌های واکنش به 35 چرخه افزایش یافت و همچنین زمان بسط اولیه، با توجه به طول ناحیه مورد نظر، 90 ثانیه در نظر گرفته شد.
جدول 1- گونه‌های استفاده شده در مطالعه حاضر و مشخصات هرباریومی و مولکولی گونه‌ها
|
شماره ثبت توالی |
مشخصات هرباریومی (vucher) |
بخش (section) |
گونه |
|
ITS: AB727530 |
تهران، رباط کریم، 72296 (TARI) |
Ornithopodium |
Astragalus brachyodontus Boiss. |
|
ITS: AB727531 |
30 کیلومتری قزوین به منجیل، 55145 (TARI) |
Ornithopodium |
A. glochideus Boiss. |
|
ITS: AB727532 |
22 کیلومتری خوی به سلماس، 45696 (TARI) |
Ornithopodium |
A. jodostachys Boiss. |
|
ITS: AB727533 |
مازندران، مرزن آباد، 82421 (TARI) |
Ornithopodium |
A. lunatus Pall. |
|
ITS: AB727534 |
20 تا 40 کیلومتری گیوی از اردبیل، 80129 (TARI) |
Ornithopodium |
A. ornithopodioides Lam. |
|
ITS: AB727535 |
جلفا به چالدوران، 347 (TARI) |
Ornithopodium |
A. shelkovnikovii Grossh. |
|
ITS: AB727536 |
آذربایجان، 13 کیلومتری ونیار به اهر، 82512 (TARI) |
Ornithopodium |
A. stevenianus DC. |
|
ITS: AB721936 |
شاهرود، کوه رازه، 20112 (SBUH) |
Dissitiflori |
A. argyroides Beck. |
|
ITS: AB721944 |
آباده، مهکستان، 2183 (TARI) |
Dissitiflori |
A. pravitzii Podl. |
|
ITS: AB721945 |
سمنان، شاهرود، جنوب کوه رازه، 20118 (TARI) |
Dissitiflori |
A. ruscifolius Boiss. |
|
ITS: AB727518 |
16کیلومتری اهر به طرف تبریز، 84011 (TARI) |
Onobrychoidei |
A. onobrychis L. |
|
ITS: AB727511 |
45 کیلومتری شمال مشهد، 21366 (TARI) |
Onobrychoidei |
A. brevidens Freyn & Sint. |
|
ITS: AB727513 |
ماکو، چالدوران به طرف خوی، مهلملو، 84074 (TARI) |
Onobrychoidei |
A. cancellatus Bunge. |
|
ITS: AB727521 |
ماکو، 11کیلومتری شوط به طرف چالدوران، 82555 (TARI) |
Onobrychoidei |
A. sevangensis Grossh. |
|
ITS: AB727516 |
20کیلومتری فیروزکوه به طرف سمنان، 58962 (TARI) |
Onobrychoidei |
A. lilacinus Boiss. |
|
ITS: AB051966 matK: (Kazempour Osaloo et al., Unpubl. data) |
بلوچستان، راسک به طرف سرباز 10108 (TARI) |
Caraganella |
A. stocksii Benth. |
|
ITS: AB231092 matK: (Kazempour Osaloo et al., Unpubl. data) |
فلور شوروی سابق، 5732 (TARI) |
Cenanthrum |
A. frigidus (L.) Gray. |
جدول 2- صفات ریخت‌شناختی و کدگذاری حالت‌های استفاده شده در تحقیق حاضر
|
Habit ≠1. Height: ≤15 cm (0), 15-50 cm (1), >50 cm (2) Stem ≠2. Branching: low (0), high (1) Stipule ≠3. Stipule size: ≤ 2 mm (0), > 2 mm (1) ≠4. Stipule color: greenish (0), white (1) ≠5. Hair compression: dispersed (0), dense (1) ≠6. Hair color: only white (0), white mixed with black (1) Leaf ≠7. Leaf size: ≤ 2 cm (0), 2-7 cm (1), > 7 cm (2) ≠8. Leaflet pairs no.: ≤ 3 (0), 3-10 (1), > 10 (2) ≠9. Leaflet L/W ratio: ≤ 1.5 (0), > 1.5 (1) ≠10. Leaflet shape: linear (0); oblong elliptic (1), obovate (2) ≠11. Leaflet indumenta type: both sides densely covered (0), both sides dispersedly covered (1), one side densely and other one dispersedly covered (2) Inflorescence ≠12. Black hair on peduncle: absent (0), presence (1) ≠13. Inflorescence type: sparse raceme (0), dense raceme (1), head (2) Calyx ≠14. Calyx type: campanulate (0), tubular (1), gibbose tubular (2) ≠15. Calyx hair symmetry: symmetrical (0), asymmetrical (1) ≠16. Calyx teeth type: equal (0), unequal (1) ≠17. Calyx teeth internal surface hair: absent (0), presence (1) Corolla ≠18. Corolla color: yellow (0), purple (1), blue (2) ≠19. Standard L/W ratio: ≤ 2.5 (0), > 2.5 (1) ≠20. Standard shape: elliptic (0), obovate (1), rhomboid (2) ≠21. Standard tip: obtuse (0), acute (1), emarginated (2) Style ≠22. Style hair: absent (0), presence (1) Pod ≠23. Pod shape: linear (0), elliptic (1) ≠24. Pod L/W ratio: ≤ 3 (0), 3-15 (1), > 15 (2) ≠25. Hair compression on pod: dispersed (0), dense (1) ≠26. Black hair on pod: absent (0), presence (1) |
جدول 3- ماتریس عددی حاصل از کددهی حالات مختلف صفات ریخت‌شناختی
|
11111111112222222 12345678901234567890123456 |
Character No. Taxa |
|
21100121022000000001210001 |
A. frigidus |
|
21000000020100010001210100 |
A. stoksii |
|
00010011120002000000210000 |
A. pravitzii |
|
10000010120102001011200000 |
A. ruscifolius |
|
10100011120102001211210001 |
A. argyroides |
|
11110111110101011202200100 |
A. brachyodontus |
|
11110112111101010201100111 |
A. jodostachys |
|
11111112111101011201100111 |
A. glochideus |
|
11110112111001001110100101 |
A. lunatus |
|
11100112120120001202200110 |
A. ornithopodioides |
|
11100111000111011202100110 |
A. shelkovnikovii |
|
11111111110111011211110101 |
A. stevenianus |
|
11110112111101011212101110 |
A. onobrychis |
|
11111121110111011211110101 |
A. cancellatus |
|
11110102111101011212101110 |
A. lilacinus |
|
11111111110121101212000110 |
A. brevidens |
|
11111112101120101211200110 |
A. sevangensis |
جدول 4- توالی پرایمرهای استفاده شده برای واکنش‌های زنجیره‌ای پلیمراز، F: پرایمر پیشرو، R: پرایمر معکوس
|
توالی پرایمر |
نام پرایمر |
ناحیه |
|
5´-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3´ 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´ |
ITS5m (F) ITS4 (R) |
ITS1+ITS2 |
|
5´-AGGAATTCATGGTCCGGAAGTC-3´ 5´-TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC-3´ |
AB101F AB102R |
|
|
5´-GTATCGCACTATGTATCATTTGA-3´ 5´-TTGCATAGAAATAGATTCGCTCAAA- 3´ |
trnK-F matK-R |
matK |
پس از اطمینان از صحت PCR و تکثیر قطعه مورد نظر به کمک الکتروفورز روی ژل آگاروز، تک باندهای قوی(20 نانوگرم) و فاقد باند اضافی وکشیدگی به منظور تعیین توالی به پژوهشگاه فناوری‌های نوین جهاد دانشگاهی ابن سینا (تهران)، ارسال شد و توسط بخش تحقیقات ژنتیک مولکولی این پژوهشگاه توسط دستگاه ABI Genetic analyzer 3130 تعیین توالی گردید. برای توالی‌یابی ناحیه nrDNA ITS از آغازگرهای ITS5m یا AB101F و برای توالی‌های کلروپلاستی از F-trnK استفاده شد.
آنالیزهای فیلوژنتیک
داده‌های ریخت‌شناختی: آنالیز فیلوژنتیکی پس از تشکیل ماتریس داده‌ای، به کمک نرم‌افزار PAUP* نسخه 4b10 (Swofford, 2002) و با استفاده از روش بیشینۀ صرفه‌جویی (maximum parsimony) انجام شد. کدگذاری صفات به صورت نامرتب است. ابتدا همۀ صفات به صورت هم‌وزن (equal weighting) وارد آنالیز شدند. کلیه صفات وارد شده، از نظر بیشینۀ صرفه‌جویی، حاوی اطلاعات بودند. تنظیمات مراحل مختلف آنالیز بدین صورت بود که از روش جستجوی اکتشافی (heuristic) با روش افزایش گام به گام و تصادفی با 1000 تکرار و روش بهینه‌سازی حالات صفات ACCTRAN، به همراه تکنیک مبادلۀ شاخه به روش دونیمه‌سازی درخت و اتصال مجدد (TBR) استفاده شد. کلیه کوتاه‌ترین درختان به دست آمده از آنالیز، خلاصه شده و به صورت درخت مطلق مرکزی (strict consensus tree) ارائه گردید. در ادامه، به منظور کاهش اثر هموپلازی (هم‌نمایی) در میان صفات ریخت‌شناختی، از روش وزن‌دهی مجدد صفات (reweighting) با استفاده از شاخص RC (Rescaled Consistency Index) استفاده شد (Farris, 1989). پس از سه دور وزن‌دهی مجدد، هیچ تغییری در شاخص‌های درختان به دست آمده، مشاهده نشد. لذا پس از این مرحله، درخت مطلق مرکزیبه روش بیشینۀ صرفه‌جویی محاسبه و ارائه شد. به منظور ارزیابی حدود اطمینان شاخه‌ها، از روش بوتستراپ (bootstrap) (Felsenstein, 1985) استفاده شد.
داده‌های مولکولی: در ابتدا کروماتوگرامهای حاصل از تعیین توالی نمونه‌ها، با استفاده از نرم‌افزار Bioedit، ویرایش شده، سپس توالی‌های مورد اشاره با استفاده از نرم‌افزار Clustal X (Larkin et al., 2007) هم‌ردیف گردیدند. سپس ماتریس داده‌های هم‌ردیف‌سازی شده برای هر دو قطعه DNA مورد نظر، به کمک نرم‌افزار MrBayes نسخه 12/3
(Ronquist and Huelsenbeck, 2003) به صورت جداگانه و ترکیب با یکدیگر، بررسی و تحلیل شدند.
برای انجام آنالیز فیلوژنی بر اساس روش Bayesian، با استفاده از برنامه MrModeltest نسخه 3/2 و بر اساس معیار اطلاعاتی AIC
(Akaike information criterion)، مدل‌های تکاملی مناسب برای داده‌های مورد نظر، انتخاب شدند (Posada and Buckley, 2004). طبق این آزمون، به ترتیب مدل‌های SYM+I+G برای توالی
nrDNA ITS، GTR+I برای ژن matK کلروپلاستی و HKY+I برای ماتریس داده‌های ترکیبی، انتخاب شده و با استفاده از برنامه MrBayes نسخه 12/3 آنالیزهای فیلوژنتیک انجام شد. برای هر ماتریس، دو اجرای جداگانه به منظور دستیابی به نمونه‌های خوبی از توزیع احتمال پسین (حمایت شاخه‌ای) (PP, posterior probability)، برای دو میلیون نسل اجرا شد و هر صد نسل، یک درخت نمونه‌برداری شد. پس از پایان اجرای برنامه، میانگین انحراف معیار برای توالی‌های هسته‌ای، ژن matK کلروپلاستی و ماتریس ترکیبی، به ترتیب 002/0، 003/0 و 003/0 بود. در نهایت، پس از تکمیل آنالیزهای مربوطه، 25 درصد درختان جمع‌آوری شده، سوزانده و باقیمانده آنها به صورت درخت اجمالی 50 درصد همراه با مقادیر مربوط به حمایت شاخه‌ای (PP) در بخش نتایج ارائه شدند. حمایت شاخه‌ها در روش Bayesian با اعداد مربوط به احتمال پسین بیان می‌شود. به منظور ارزیابی ترکیب‌پذیری داده‌های مربوط به دو ناحیه مختلف ژنومی، آزمون تفاوت طول ناسازگاری (ILD test) به وسیله نرم‌افزار Paup انجام شد
(Farris et al., 1995).
نتایج
مطالعه داده‌های ریخت‌شناختی
آنالیز فیلوژنتیک ویژگی‌های ریخت‌شناختی به روش بیشینۀ صرفه‌جویی در ابتدا به ایجاد 8 کوتاه‌ترین درخت (most parsimonious) به طول 83 گام و شاخص پایداری (CI, Consistency Index) برابر با 538/0 و شاخص ابقا (RI, Retention Index) برابر با 689/0 منجر گردید. در درخت مطلق مرکزی حاصل از این آنالیز که بر روی صفات ریخت‌شناسی هم‌وزن انجام شد، گونه‌های بخش Ornithopodium و Onobrychoidei، یک کلاد واحد با پلی‌تومی بالا تشکیل دادند. همچنین در این درخت سه گونه
A. ruscifolius، A. argyroides به همراه A. pravitzii با تشکیل یک شاخه مجزا، از بقیه گونه‌ها جدا می‌شوند (این درخت نشان داده نشده است). به منظور کاهش اثر هوموپلازی صفات، از روش وزن‌دهی مجدد بر اساس شاخص RC استفاده شد که در نهایت سه درخت به عنوان کوتاه‌ترین درخت با طول 26 گام و شاخص پایداری برابر 730/0 و شاخص ابقا برابر با 811/0 به دست آمد. درخت مطلق مرکزی این سه درخت همراه با ارزش‌های بوتستراپ در شکل 1 ارائه شده است. توپولوژی کلی این درخت با درخت حاصل از آنالیز صفات هم‌وزن یکسان است، با این تفاوت که رابطه برخی گونه‌ها با یکدیگر حل شده است. همان‌طور که در شکل 1 دیده می‌شود، تمام گونه‌های بخش‌های Ornithopodium و Onobrychoidei در کنار یکدیگر قرار داشته و از اعضای بخش Dissitiflori جدا شده‌اند. در اینجا نیز گونه‌های دو بخش اول، به صورت آمیخته با یکدیگر قرار دارند. به طوری که در برخی موارد دو گونه با هم تشکیل گروه خواهری داده، رابطه بعضی دیگر، به صورت حل نشده باقیمانده است (شکل 1).
|
شکل 1- درخت مطلق مرکزی حاصل از آنالیز صفات ریخت‌شناختی وزن‌دهی شده به روش پارسیمونی. اعداد بالای شاخه‌ها ارزش‌های بوتستراپ هستند (ارزش‌های کمتر از 50 درصد نشان داده نشده‌اند). |
مطالعۀ داده‌های مولکولی
داده‌های حاصل از nrDNA ITS
آنالیز داده‌های مربوط به توالی nrDNA ITSبه روش Bayesian، یک درخت فیلوژنی با دو کلاد اصلی ایجاد کرد که سه گونۀ A. argyroides،
A. pravitzii و A. ruscifolius در یک تبار با هم و بقیه گونه‌ها در تبار دوم قرار می‌گیرند (شکل 2). توپولوژی کلی این درخت، مشابه درخت به دست آمده از آنالیز صفات ریخت‌شناختی است. با توجه به نتیجۀ این آنالیز، گونۀ A. onobrychisبا حمایت 91/0 از سایر گونه‌های مطالعه شده جدا شده، به عنوان گروه خواهری در کنار گونه‌های خویشاوند خود قرار می‌گیرد. همچنین، دو گونه A. brachyodontus و A. jodostachys گروه خواهری تشکیل داده‌اند. به هر حال، روابط میان بقیه گونه‌های این دو بخش از جنس گون به صورت حل نشده باقی مانده است (شکل 2).
داده‌های حاصل از توالی‌های matK کلروپلاستی
درخت فیلوژنی حاصل از این آنالیز دارای دو تبار عمده است، به طوری که سه گونه متعلق به بخش Dissitiflori با حمایت 94/0 تشکیل یک تبار مستقل داده، باقیماندۀ گونه‌ها تشکیل تباری دیگر را می‌دهند (شکل 3). درون تبار اخیر، که گونه‌های بخش Ornithopodium و Onobrychoidei را شامل می‌شود، دو زیرشاخه تشکیل شده که یکی دیکوتومی A. glochideus و A. brachyodontus با حمایت 88/0 و دیگری یک تبار چند شاخه از گونه‌های هر دو بخش است. همان‌طور که در شکل 3 مشاهده می‌شود، گونه‌های دو بخش مذکور بر اساس اطلاعات حاصل از توالی ژن matK به صورت آمیخته با هم قرار گرفته‌اند و درصد بالایی از تشابه را نشان می‌دهند. نتیجه این آنالیز بسیار شبیه به آنالیز داده‌های ITS است با این تفاوت که در آنالیز مربوط به ITS گونۀ
A. onobrychis گروه خواهری بقیه گونه‌های این بخش‌هاست.
آنالیز داده‌های ترکیبی حاصل از توالی‌های ITS و matK
نتیجۀ آزمون ILD تا حدودی نشان‌دهندۀ عدم تجانس فیلوژنی میان داده‌های این دو ناحیه است (p=0.04)، اما با توجه نظر برخی از پژوهشگران مبنی بر غیرقابل اعتماد بودن این آزمون در بیشتر موارد (Seelanan et al., 1997; Wiens, 1998; Yoder et al., 2001)، و همچنین، شباهت کلی در توپولوژی درختان به دست آمده از ماتریس‌های داده‌ای منفرد، تصمیم گرفتیم داده‌های حاصل از این دو ناحیه ژنومی را به صورت ترکیب شده نیز آنالیز کنیم. درخت فیلوژنی حاصل از این آنالیز (شکل 4)، شامل دو تبار اصلی است: درون یکی از این شاخه‌ها، سه گونه
A. argyroides، A. pravitzii و A. ruscifolius جای گرفته‌اند و تبار دوم که تبار بزرگتری است، گونه‌های مطالعه شده از دو بخش Ornithopodium و Onobrychoidei را شامل می‌شود (شکل 4). جدایی گونه‌های دو بخش اخیر از بخش Dissitiflori با عدد احتمال پسین 00/1 حمایت می‌شود.
شکل 2- درخت فیلوژنی حاصل از آنالیز داده‌های مربوط به ناحیه ITS به روش Bayesian. اعداد بالای شاخه به احتمال پسین (PP) مربوط هستند.
شکل 3- درخت فیلوژنی حاصل از آنالیز داده‌های مربوط به ناحیه ژن matK به روش Bayesian. اعداد بالای شاخه‌ها احتمال پسین (PP) یا همان اعداد مربوط به حمایت شاخه‌ها هستند.
شکل 4- آنالیز داده‌های ترکیبی حاصل از توالی‌های ITS و matK به روش Bayesian. اعداد بالای شاخه‌ها، احتمال پسین (PP) یا همان اعداد مربوط به حمایت شاخه‌ها هستند.
بحث و نتیجه‌گیری
بخشOrnithopodium از جنس گون، در اصل به وسیلۀ Bunge (1868-1869) با 9 گونه معرفی شد. این بخش امروزه حدود 17 گونه در آسیای میانه و غربی و بخش‌هایی از اروپا را داراست و 7 گونه از آنها در ایران می‌روید. بخش غربی حوزه ارمنی-ایرانی از ناحیه ایرانی-تورانی، به عنوان مرکز گونه‌زایی و تنوع این بخش در نظر گرفته می‌شود (Podlech, 1999).
این بخش از جنس گون بر اساس ویژگی‌هایی، همچون ساقه‌های علفی با میانگرههای بلند؛ کرک‌های دو شاخه‌ای متقارن و خوابیده در سطح گیاه؛ کاسه استکانی شکل و میوه‌های خطی و طویل، قابل تشخیص است (Maassoumi, 2005). بخش Ornithopodium به علت دارا بودن میوه‌های خطی و طویل، و میانگرههای بلند دارای اشتراکاتی با بخش Dissitiflori است، اما بر اساس صفات مربوط به کاسه و جام گل به راحتی از هم جدا می‌شوند (Ranjbar, 2004).
بخش Onobrychoidei از جنس گون نیز یک بخش بسیار نزدیک از نظر ریخت‌شناختی به بخش Ornithopodium است. این بخش شامل گیاهانی چندساله با ساقه‌های علفی و میانگرههای طویل، کاسه گل استکانی شکل و میوه‌های بیضوی یا بیضی کشیده است. بارزترین تفاوت این بخش با بخش Ornithopodium در شکل میوه است، به طوری که میوه در بخش اخیر، خطی-هلالی است. با توجه به این صفت، ارتباط اورنیتوپودیوم با بخش دیسیتی فلوری بیشتر مشخص می‌شود، اما از نظر شکل و اندازه کاسه وگل، بیشتر به بخش Onobrychoidei ارتباط می‌یابد (Ghahremani-Nejad, 2004; Maassoumi, 2005). آنالیزهای تبارشناختی روی صفات ریخت‌شناختی در تحقیق حاضر، نشان داد که اعضای بخش Ornithopodium در ارتباط بسیار نزدیک با بخش Onobrychoidei هستند (شکل 1). به هر حال، در هر دو آنالیز تبارشناختی روی صفات هم‌وزن و وزن‌دهی شده، تمام گونه‌های مربوط به این دو بخش به صورت آمیخته با هم، تشکیل یک تبار واحد را می‌دهند، که اگرچه روابط درون این تبار به خوبی حل نشده، اما نشان‌دهندۀ ارتباط نزدیک مورفولوژیک این دو بخش با هم و تمایز آنها از اعضای بخش Dissitiflori است.
در مطالعه جامعی که چارچوب فیلوژنی کل جنس گون را بررسی کرده است، نماینده‌های استفاده شده از دو بخش Ornithopodium و Onobrychoidei، بدون هیچ گونه تفکیک قابل ملاحظه‌ای درون یک زیرشاخه از تبار بزرگ "F" قرار دارند (Kazempour Osaloo et al., 2003, 2005). همچنین، در مطالعه‌ای که اخیراً بر اساس صفات مربوط به ریخت‌شناسی و ریزریخت‌شناسی دانه روی اعضای این دو بخش انجام شده، بیان شد که اعضای این دو بخش از نظر صفات مذکور، کاملاً وابسته به هم بوده، هیچ تمایزی را بر اساس ویژگی‌های دانه نشان نمی‌دهند (Vural et al., 2008). آنالیز دو ناحیه مختلف ژنومی در این مطالعه، به صورت جداگانه و ترکیب شده دارای نتایج تقریباً مشابهی است. در کلیه آنالیزهای مولکولی انجام شده در تحقیق حاضر، گونه‌های مربوط به بخش Dissitiflori A. argyroides) و (A. ruscifolius به همراه گونۀ A. pravitzii، با هم تشکیل یک تبار واحد و جدا از بقیه گونه‌ها را می‌دهند (شکل‌های 2، 3 و 4) و اعضای دو بخش Ornithopodium و Onobrychoidei نیز به صورت پراکنده در بین یکدیگر و درون دیگر تبار مجزا قرار می‌گیرند. بنابراین، نتایج ما، نشان‌دهندۀ ارتباط بسیار نزدیکِ خویشاوندی و تبارشناختی دو بخش اخیر است. این یافته، در انطباق با مطالعات قبلی کلاسیک و مولکولی است که با استفاده از میکرومورفولوژی بذر و یا توالی nrDNA ITS بر روی بخش‌های مذکور از جنس Astragalus انجام شده است.
pravitzii A. نخستین بار توسط Podlech به عنوان یک گونه جدید و بوم‌زاد از فلور ایران و متعلق به بخش Dissitiflori معرفی شد (Podlech, 2001). در جدیدترین بازنگری انجام شده بر روی گونهای منطقه فلورا ایرانیکا، Podlech و Sytin (2010) گونه
A. pravitzii را از بخش مذکور جدا و به بخش Ornithopodium منتقل کردند. نتیجۀ آنالیز تبارشناختی صفات ریخت‌شناختی و همچنین، نتایج کلیه آنالیزهای فیلوژنی مولکولی انجام شده در این تحقیق، نشان می‌دهند که این گونه هیچ وابستگی به بخش Ornithopodium نداشته و بنابراین، انتقال آن به این بخش تأیید نشده است و این گونه مجدداً به بخش Dissitiflori منتقل می‌شود.
تشکر و قدردانی
از معاونت پژوهشی و فناوری دانشگاه شهید بهشتی به خاطر حمایت مادی بخشی از این تحقیق، طی طرح پژوهشی مصوب آن معاونت محترم، تشکر می‌شود.
)