ارزیابی تنوع ژنتیکی و روابط خویشاوندی گونۀ Trifolium tomentosum با استفاده از روش CDDP در ایران

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسنده

استادیار گروه زیست‌شناسی، دانشگاه پیام نور، تهران، ایران

چکیده

گونۀTrifolium tomentosum L.گیاهی یک‌ساله در ناحیۀ مدیترانه و غرب ناحیۀ ایرانی - تورانی است که در غرب و جنوب‌غرب ایران نیز یافت می‌شود. این گونه به‌علت تحمل زیاد نسبت به خاک‌های شور و غرقابی و مناسب‌بودن برای تغذیۀ دام گزینۀ مناسبی برای احیای مراتع و دارای سه واریتۀ tomentosum، curvisepalumوchthonocephalum در ایران است. پژوهش حاضر به بررسی میزان تنوعات ژنتیکی و روابط خویشاوندی فروگونه‌ای با استفاده از روشCDDPدر 40 فرد از 10 جمعیت این گونه پرداخته است. از مجموع 12 آغازگر
117 باند حاصل شد که از این میان، 115 باند(29/98 درصد) چندشکل بودند.بر اساس نتایج تجزیۀ خوشه‌ای، افراد در دو گروه مجزا طبقه‌بندی شدند که خوشۀ اول شامل واریتۀ tomentosum و خوشۀ دوم شامل واریته‌های curvisepalum و chthonocephalum بود. بیشترین میانگین تنوع ژنتیکی نی (H)و شاخص اطلاعاتی شانون (I) در واریتۀ chthonocephalum مشاهده شد. تجزیه واریانس مولکولی نیز نشان داد تنوع ژنتیکی درون‌جمعیتی
(62 درصد) بیشتر از تنوع ژنتیکی بین‌جمعیتی (38 درصد) است که مؤید دگرلقاح‌بودن این گونه است. به‌طور‌کلی بر اساس نتایج پژوهش حاضر، واریته‌های curvisepalum و chthonocephalum از گونۀ T. tomentosum شبیه‌ترند که با نتایج مطالعه‌های قدیمی‌تر بر مبنای نشانگرهای SSR و IRAP همخوانی ندارد و ازاین‌رو، واریته‌های
T. tomentosum بسیار شبیه‌اند و نشانگرهای مولکولی استفاده‌شده نمی‌توانند واریته‌های این گونه را به‌خوبی جدا کنند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evaluation of Genetic Diversity and Relationships of Trifolium tomentosum based on CDDP Method in Iran

نویسنده [English]

  • Maryam Haerinasab
Assistant Professor Department of biology, Payame Noor Universtiy, Tehran, IRAN
چکیده [English]

Trifolium tomentosum L. is an annual plant in the Mediterranean and western part of the Iran-Turanian region, which is also found in the west and southwest of Iran. Due to its high tolerance to saline and flood soils and the suitability of feeding livestock, this can be a good alternative to rangeland rejuvenation. This species has three varieties of tomentosum, curvisepalum and chthonocephalum in Iran. This study investigates genetic variation and relationships in 40 individuals from 10 populations of this species using CDDP method. Out of 12 primers, 117 bands were obtained, of which 115 (98.29%) were polymorphic. Based on the results of cluster analysis, the samples were classified into two distinct groups, the first cluster including var. tomentosum and the second cluster including curvisepalum and chthonocephalum varieties. The mean genetic variation of Nie (H) and Shannon's information index (I) were highest in var. chthonocephalum. The analysis of molecular variance also showed that the intra-population genetic diversity (62%) was higher than inter-population genetic variation (38%), which confirms the outbreeding of this species. In general, according to the results of this study, curvisepalum and chthonocephalum varieties of T. tomentosum are more similar, which are not consistent with the results of older studies based on SSR and IRAP markers, and it can be said that the varieties of T. tomentosum are very similar and the molecular markers cannot separate the varieties of this species well.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Iran
  • Genetic Diversity
  • Trifolium Tomentosum
  • CDDP Method

مقدمه

گونۀ Trifolium tomentosum L. گیاهی یک‌ساله، خودلقاح و متعلق به خانوادۀ Fabaceae است (Taylor and Gillett, 1988). این گونه دارای چندشکلی زیادی است؛ به‌طوری‌که بر اساس نظر Zohary و Heller (1970 و 1984) دارای شش واریتـه شامل T. tomentosum var. tomentosum،T.
 tomentosum
var. curvisepalum (Tackh) Thieb.، T. tomentosum var. chthonocephalum Bornm.، T. tomentosum var. lanatum Zoh.،
 T. tomentosum var. orientale Bornm. و
T. tomentosum var. philistaeum Zoh. است. تفاوت عمدۀ واریته‌های یادشده در طول دم‌گل‌آذین‌ها، قطر گل‌آذین‌ها، تراکم و رنگ پوشش کرکی کاسۀ گل، طول و شکل دندانه‌های کاسه است. تصاویر سیاه‌قلم این واریته‌ها در مونوگراف جنس Trifolium آورده شده است (Zohary and Heller, (1984. در فلورا ایرانیکا (Heller, 1984) تنها دو واریته tomentosum و curvisepalum برای ایران گزارش شده است که بلندتربودن دندانه‌های پایینی کاسه در واریتۀ curvisepalumبارز‌ترین تفاوت آنها است. در سال 2012، دو واریتۀ tomentosumو curvisepalumبر اساس نتایج مطالعه‌های ریخت‌شناسی و مولکولی بر مبنای نشانگرهای SSR و IRAP درهم ادغام شدند و واریتۀ chthonocephalum برای نخستین‌بار از ایران گزارش شد(Haerinasab, 2012; Haerinasab and (Rahiminejad, 2012. در واریتۀ chthonocephalum گل‌آذین‌ها همگی در قاعدۀ گیاه مجتمع‌اند و برگ‌های دارای دمبرگ طویل بالاتر از آنها قرار می‌گیرند. کلید شناسایی ارائه‌شده برای سه واریته در مونوگراف جنس Trifolium به شرح زیر است (Zohary and Heller, 1984):

 

 

1- گل‌آذین در مرحلۀ میوه نسبتاً تنک و لوب‌دار (کاسه‌های میوه قدری جدا از هم و واگرا در بخش بالایی)، دندانه‌های بالایی کاسه ریش‌مانند، به‌شدت خمیده به پشت و پیش‌آمده از سطح گل‌آذین با گردن کاسه‌ مخروطی یا استوانه‌ای، گل‌آذین‌ها در حالت میوه بخشی بدون دم‌گل‌آذین و بخشی روی دم‌گل‌آذین‌های اکثراً 1 تا 5/1 سانتی‌متری. برگچه‌های بالاتر واژسه‌گوش طویل، گوه‌ای و گیاهان بیابان.

var. curvisepalum

1- گل‌آذین‌ها در مرحلۀ میوه به‌طور یکنواخت کروی. دندانه‌های کاسه‌مانند بالا نیست.

2

2- گل‌آذین‌ها همگی مجتمع در قاعدۀ گیاه و برگ‌های با دمبرگ طویل بالاتر از آنها قرار می‌گیرند.

var. chthonocephalum

2- گل‌آذین‌ها در طول یا در رأس ساقه‌ها و انشعابات، گل‌آذین‌ها در مرحلۀ میوه کرکی نرم، با رگ‌بندی مشبک قابل‌رؤیت. دندانه‌های بالایی کاسه افقی، اغلب فشرده به لوله. دمگل‌آذین‌ها واضح، خمیده به پایین.

var. tomentosum

 


T. tomentosumیکی از گونه‌های مرتعی و خوش‌خوراک برای تغذیۀ دام است و با‌توجه‌به مقاومت زیادی که نسبت به خاک‌های شور و غرقابی دارد گزینۀ مناسبی برای احیای مراتع است (Marticorena (and Quezada, 1985. این گیاه بومی اروپا، غرب آسیا و شمال آفریقا است و دامنۀ پراکنش محدود و مشخصی در کشور ایران دارد و تنها در غرب و جنوب‌غرب ایران یافت می‌شود (شکل 1)؛ به عبارتی دارای خزانۀ وراثتی پیوسته‌ای در غرب و جنوب‌غرب کشور است (Haerinasab, 2012).

 

 

شکل 1- پراکنش جغرافیاییL.  Trifolium tomentosum در ایران (Haerinasab, 2012)

 

 

نشانگرهای ژنتیکی اطلاعات مفیدی دربارۀ مقدار و شیوۀ توزیع تنوعات ژنتیکی درون و بین جمعیت‌ها فراهم می‌کنند (Belletti et al., 2008) و ابزار کارآمدی برای توصیف و کمّی‌کردن تنوع ژنتیکی جمعیت‌ها هستند (Avise, 1994). در سال 2009، روش CDDP(Conserved DNA-Derived Polymorphism) روش جدیدی برای تهیۀ نشانگرهای گیاهی بر پایۀ نواحی حفاظت‌شدۀ DNA معرفی شد (Collard and Mackill, 2009). روش CDDP روشی است که در آن با استفاده از نواحی بسیار حفاظت‌شدۀ پروتئین‌ها و طراحی آغازگرهایی بر اساس این نواحی اقدام به تکثیر DNA می‌شود. این پروتئین‌ها معمولاً حاصل بیان ژن‌های عملکردی رایج مانند ژن‌های کدکنندۀ هومئوباکس (KNOX) یا پروتئین متصل‌شونده به اکسین (ABP1) هستند (Poczai et al., (2013. این روش ژن‌هایی را هدف قرار می‌دهد که به‌طور مستقیم در پاسخ گیاه به تنش‌های زنده و غیرزنده درگیر هستند؛ هرچند امکان افزایش‌دادن دامنۀ کاربرد آن با استفاده از علم بیوانفورماتیک وجود دارد. CDDPبه‌آسانی نشانگرهایی کاربردی فراهم می‌کند که به فنوتیپ گیاه وابسته‌اند. اگرچه نواحی محافظت‌شده معمولاً دارای توالی یکسان و یا بسیار مشابه‌اند، تفاوت توزیع آنها در سراسر ژنوم چندشکلی‌های زیادی را آشکار می‌کند (Poczai et (al., 2011.روش یادشده بر اساس تک‌آغازگرهای بلند با دمای اتصال زیاد طراحی شده است که سبب کاهش میزان خطا در اتصال آغازگر و افزایش تکرارپذیری آن می‌شود(Collard and Mackill, (2009.در این روش همانند روش‌های دیگر مانند RAPD و ISSRطراحی آغازگرها بر اساس توالی ابتدا و انتهای قطعه‌های DNAانجام می‌شود با این تفاوت که در این روش قطعه‌های تکثیرشده نواحی حفاظت‌شدۀ یک ژن خاص‌اند.ساده‌بودن، نیاز به کمترین امکانات آزمایشگاهی و نیاز به DNAالگوی بسیار کمتر نسبت به سایر روش‌ها از مزایای این روش و تولید چندشکلی کمتر و نیاز به دانستن توالی DNA از معایب آن‌اند (Poczai et al., 2011; Li et al., 2013). Cicer arietinum L. (Hajibarat et al., 2015)، Chrysanthemum morifolium Ramat. (Li (et al., 2013 و Solanum dulcamara L. (Poczai et al., 2011) از معدود گیاهانی هستند که با این روش بررسی شده‌اند.

تاکنون نشانگرهای مولکولی به‌طور خاص در گونۀ T. tomentosum استفاده نشده‌اند و یکی از دلایل احتمالی آن تعدد گونه‌های زراعی مهم ازجمله
T. repens وT. pratense در این جنس است که بیشتر مطالعه‌ها را به خود معطوف کرده‌اند. از سوی دیگر، قرارگیری کشور ایران در اقلیم خشک و نیمه‌خشک و لزوم توجه و حفاظت از مراتع ارزشمند کشور با استفاده از گیاهان مفید، T. tomentosum را گیاهی خوش‌خوراک برای دام و مقاوم به شوری در اولویت انتخاب برای احیای مراتع قرار می‌دهد. نظر به اینکه تاکنون مطالعه‌ای دربارۀ تنوع ژنتیکی این گونۀ مهم انجام نشده است و اطلاعات موجود تا حد زیادی مخدوش و غیرقابل‌استناد است، در پژوهش حاضر برای بررسی تنوع ژنتیکی این گونه و روابط خویشاوندی در سطح فروگونه‌ای از نشانگر CDDP (نشانگری نسبتاً جدید و احتمالاً با کارایی زیاد) استفاده شد.

 

مواد و روش‌ها

در پژوهش حاضر، 40 فرد از 10 جمعیت مطالعه شدند که در این میان، 5 جمعیت به T. tomentosum var. tomentosum، 2 جمعیت به T. tomentosum var. curvisepalum و 3 جمعیت به T. tomentosum var. chthonocephalum تعلق داشتند. اطلاعات مربوط به جمعیت‌های بررسی‌شده در جدول (1) دیده می‌شود. جمع‌آوری‌ها به‌شکلی انجام شدند که تاحدامکان کل دامنۀ پراکنش این گونه در ایران را پوشش دهند. نمونه‌های سند در هرباریوم دانشگاه اصفهان نگهداری می‌شوند.

در مطالعۀ حاضر، استخراج DNA به روش Lefort و Douglas (1999) انجام شد. غلظت نمونه‌های DNA از طریق مقایسۀ موقعیت و شدت باند حاصل از DNA با الگوی باندبندی حاصل از نشانگر l تعیین شد. واکنش PCR در حجم نهایی 10 میکرولیتر انجام شد و مخلوط واکنش PCR شامل 8/0 میکرومول آغازگر، بافر PCR 1x، 24/0 میلی‌مول مخلوط dNTP،
5/1 میلی‌مول MgCl2، 5/0 واحد آنزیم
Taq polymerase و 25 نانوگرم DNA ژنومی بود. برنامۀ PCR به این شکل انجام شد: 4 دقیقه در 94 درجۀ سانتی‌گراد، به دنبال آن 35 چرخه شامل 1 دقیقه در
94 درجۀ سانتی‌گراد، 1 دقیقه در 50 درجۀ سانتی‌گراد، 2 دقیقه در 72 درجۀ سانتی‌گراد و درنهایت 5 دقیقه در 72 درجۀ سانتی‌گراد.

پس‌از انجام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، محصولات PCR روی ژل آگارز 2 درصد برده شدند. باندهای تکثیرشده در دستگاه ژل‌داک مشاهده و عکس‌برداری شدند. در این بررسی، از مجموع 16 آغازگر استفاده‌شده تنها 12 آغازگر باندهای قابل‌امتیازدهی تکثیر کردند (جدول 2).

 

 

 

جدول 1- اطلاعات مربوط به جمعیت‌های مطالعه‌شدۀ گونۀ T. tomentosum

ردیف

محل جمع‌آوری

ارتفاع از سطح دریا (m)

شمارۀ هرباریومی

کد جمعت

T. tomentosumvar. tomentosum

1

خوزستان: ایذه به دهدز، سد کارون 3

953

17917 IUH

to15A

2

فارس: نورآباد به کازرون، تنگۀ چوگان، شهر نیشابور

834

17915 IUH

to91

3

خوزستان: ملاثانی به شوشتر، 49 کیلومتری شمال‌شرق اهواز

58

17913 IUH

to81

4

لرستان: بعد‌از تنگ ملاوی

900

18052 IUH

to114

5

بختیاری: سرخون به دهدز

1736

17912IUH

toH28

T. tomentosum var. chthonocephalum

6

خوزستان: دهدز به سرخون

1303

18045 IUH

ch17

7

بختیاری: سرخون به دهدز، نزدیک سد کارون 4

1116

17908 IUH

ch77

8

خوزستان: جادۀ آغاجاری به بهبهان، حاشیۀ رودخانۀ مارون

211

18050 IUH

ch86

T. tomentosumvar. curvisepalum

9

کهگیلویه‌و‌بویراحمد: 43 کیلومتری جاده گچساران به نورآباد

841

17914 IUH

cu88A

10

آذربایجان غربی: سردشت

1360

18046 IUH

cu33

جدول 2- اطلاعات مربوط به آغازگرهای CDDP استفاده‌شده در پژوهش حاضر (Collard and Mackill, 2009)

نام ژن

عملکرد ژن

نام آغازگر

توالی آغازگر ( 3′5′)

Tm °C

CG%

WRKY

عامل رونویسی در عملکردهای تکاملی و فیزیولوژیکی

WRKY-F1

TGG CGS AAG TAC GGC CAG

61

7/66

 

WRKY-R3

GCA SGT GTG CTC GCC

54

3/73

 

WRKY-R3B

CCG CTC GTG TGS ACG

54

3/73

MADS

کنترل‌کنندۀ شروع و توسعۀ اندام گلی

MADS-1

ATG GGC CGS GGC AAG GTG C

66

7/73

 

MADS-2

ATG GGC CGS GGC AAG GTG G

66

7/73

 

MADS-4

CTS TGC GAC CGS GAG GTG

63

2/72

ABP1

کدکنندۀ پروتئین متصل‌شونده به اکسین

ABP1-1

ACS CCS ATC CAC CGC

54

3/73

MYB

ناشناخته (دخیل در متابولیسم ثانویه، تنش‌های زنده و غیرزنده، ریخت‌زایی سلولی)

MYB1

GGC AAG GGC TGC CGC

57

0/80

ERF

عامل رونویسی دخیل در مسیر مقاومت به بیماری‌ها

ERF2

GCS GAG ATC CGS GAC CC

62

5/76

KNOX

کدکنندۀ هومئوباکس

KNOX-1

AAG GGS AAG CTS CCS AAG

58

1/61

 

KNOX-2

CAC TGG TGG GAG CTS CAC

61

7/66

 

KNOX-3

AAG CGS CAC TGG AAG CC

57

7/64

 

 

باندهای مشاهده‌شده روی ژل‌ها برای انجام تحلیل‌های آماری در قالب ماتریسی از صفر و یک تنظیم شدند (حضور باند با عدد 1 و نبود آن با عدد صفر در نظر گرفته شد). برای تجزیه‌وتحلیل داده‌ها از نرم‌افزارهای NTSYS (V2.02)، PopGene32، GenAlex6.4 و PowerMarker (V3.25) استفاده شد. در نرم‌افزار PowerMarker دو آلل a (برای حضور) و b (برای نبود) در نظر گرفته شدند و ازنظر این دو آلل تمام جمعیت‌ها به‌شکل a/a و یا b/b هموزیگوت بودند.

میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) بر اساس رابطۀ PIC=1-∑fi2 با نرم‌افزار PowerMarker محاسبه شد که در این رابطه، fi با فراوانی آلل iام برابر است (Botstein et al., 1980). همچنین شاخص نشانگر (MI) برای تمام آغازگرها طبق رابطۀ MI=PIC.N.β محاسبه شد که N تعداد باندهای چند‌شکل و β درصد چندشکلی برای هر آغازگر است. شاخص قدرت تفکیک (Resolving power) برای هر آغازگر طبق رابطۀ Rp=∑Ib و میزان Ib نیز از رابطۀ Ib=1-(2|0.5-Pi|) محاسبه شد که Pi درصد فراوانی یک آلل از هر باند است (Pawell et al., 1996).

دندروگرام با استفاده از نرم‌افزار NTSYS و ضرایب Dice، Jaccard (J) و Simple Matching (SM) ترسیم شد. به‌منظور سنجش میزان انطباق دندروگرام رسم‌شده با ماتریس تشابه، میزان همبستگی کوفنتیک برای هریک از ضرایب یادشده محاسبه شد. دندروگرام رسم‌شده بر اساس ضریب Jaccard بیشترین میزان همبستگی (82/0=r) را نشان داد و بنابراین دندروگرام بر اساس ضریب تشابه Jaccard رسم شد.

به‌منظور استفادۀ بهینه و استخراج بیشترین اطلاعات از داده‌های حاصل، تجزیه به مختصات‌ اصلی (PCoA) به‌‌عنوان روش مکمل آنالیز خوشه‌ای با نرم‌افزار GenAlex6.4 انجام شد. همچنین آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) که روشی برای مطالعۀ تنوع ژنتیکی و میزان چندشکلی بین و درون جمعیت‌ها است با نرم‌افزار GenAlex6.4 انجام شد.

تجزیۀ تنوع ژنتیکی درون جمعیت‌های گونۀ
T. tomentosum با نرم‌افزار Popegene32 به کمک ضریب تشابه Nie (1973) انجام شد. در این ارزیابی تعداد آلل‌های مشاهده‌شده (Na)، تعداد آلل‌های مؤثر (Ne)، شاخص تنوع ژنتیکی نی (H) و شاخص شانون (I) برای هریک از جمعیت‌ها محاسبه شد. میزان شباهت یا تفاوت جمعیت‌ها به‌وسیلۀ ماتریس فاصله با نرم‌افزار GenALEX 6.3 تعیین شد.

 

نتایج

تنوع ژنتیکی جمعیت‌هایی از سه واریتۀ مطالعه‌شدۀ گونۀ T. tomentosumبا استفاده از 12 آغازگر CDDP بررسی شد. از مجموع 12 آغازگر استفاده‌‌شده 117 باند تکثیر شد که از این تعداد،
115 باند (به‌طور میانگین 29/98 درصد باندها) چندشکل بودند. میانگین تعداد باندهای تکثیر‌شده به ازای هر آغازگر و میانگین تعداد باندهای چندشکل برای هر آغازگر به‌ترتیب برابر 75/9 و 19/8 درصد بود. بیشترین تعداد باند چندشکل در آغازگر KNOX-2 با 12 باند و کمترین تعداد در آغازگرهای WRKY-R3 و KNOX-1 با 8 باند مشاهده شد. جمعیت ch86 با 47 باند چندشکل و میانگین
17/40 درصد و جمعیت cu88A با 30 باند چندشکل و میانگین 64/25 درصد به‌ترتیب بیشترین و کمترین تعداد باند را داشتند. 10 آغازگر از 12 آغازگر استفاده‌شده چندشکلی 100 درصدی نشان دادند و آغازگرهای WRKY-F1 و ERF2 با 88/88 درصد کمترین درصد چندشکلی را داشتند. دامنۀ باندهای ایجادشده بین 100 تا 2000 جفت باز بود. در مجموع 2 و به‌طور میانگین 25/11 درصد باند اختصاصی به‌وسیلۀ آغازگرهای‌ KNOX-1 و MADS-1 ایجاد شدند.

 

جدول 3-‌ شاخص‌های تنوع ژنتیکی با استفاده از آغازگرهای CDDP در بررسی 10 جمعیت از گونۀ T. tomentosum

ردیف

آغازگر

TNB

NPB

PPB%

NSB

PSB%

Rp

PIC

MI

دامنه تولید باند bp

1

WRKY-R3

8

8

100

0

0

54/5

39/0

12/3

1500-200

2

MADS-4

10

10

100

0

0

69/3

48/0

80/4

1700-100

3

ABP1-1

9

9

100

0

0

36/4

32/0

88/2

1400-200

4

WRKY-F1

9

8

88/88

0

0

13/3

30/0

40/2

1500-200

5

ERF2

9

8

88/88

0

0

60/3

25/0

00/2

2000-200

6

KNOX-1

8

8

100

1

5/12

54/2

49/0

92/3

2000-100

7

WRKY-R3B

11

11

100

0

0

93/2

42/0

62/4

1900-300

8

MYB1

9

9

100

0

0

38/4

47/0

23/4

2000-150

9

KNOX-2

12

12

100

0

0

25/6

34/0

08/4

2000-400

10

KNOX-3

11

11

100

0

0

73/5

36/0

96/3

1900-200

11

MADS-1

10

10

100

1

10

95/5

52/0

20/5

2000-400

12

MADS-2

11

11

100

0

0

44/7

32/0

52/3

1700-200

مجموع

 

117

115

29/98

2

25/11

-

-

-

-

میانگین

 

75/9

58/9

19/8

16/0

87/1

62/4

39/0

72/3

2000-100

 

 

TNB. تعداد کل نوارها، NPB. تعداد نوارهای چندشکل، PPB. درصد نوارهای چندشکل،
NSB. تعداد نوارهای اختصاصی، PSB. درصد نوارهای اختصاصی، Rp. قدرت تفکیک،
PIC. محتوای اطلاعات چندشکلی، MI. شاخص نشانگر. اطلاعات مربوط به آغازگرهای استفاده‌شده در جدول (2) شرح داده شده است.

بیشترین میزان قدرت تفکیک (Rp) برابر با 44/7 در آغازگر MADS-2 و کمترین آن برابر با 54/2 در آغازگر KNOX-1 مشاهده شد. میانگین Rp در آغازگرهای آزموده‌شده برابر با 62/4 بود. شاخص نشانگر (MI) در آغازگر MADS-1 دارای بیشترین مقدار (20/5) و میزان شاخص نشانگر به‌طور میانگین برابر با 72/3 بود. میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) 39/0 به دست آمد که بیشترین آن به آغازگر MADS-1 با مقدار 52/0 و کمترین آن به آغازگر ERF2 با مقدار 25/0 مربوط بود (جدول 3).

در دندروگرام حاصل از مطالعۀ حاضر، افراد در سطح تشابه 36 درصد در دو خوشه دسته‌بندی شدند. در خوشۀ اول، پنج جمعیت از T. tomentosum var. tomentosum شامل جمعیت‌های to15، to91، to81، to114 و toH28 و در خوشه دوم، دو جمعیت از
T. tomentosum var. curvisepalum شامل جمعیت‌های cu88A و cu33 و سه جمعیت از
T. tomentosum var. chthonocephalum شامل جمعیت‌های ch17، ch77 و ch86 قرار گرفتند
(شکل 2). نتایج آنالیز واریانس در جدول (4) ارائه شده است.

 

 

 

شکل 2- دندروگرام حاصل از نرم‌افزار NTSYS و ضریب تشابه جاکارد بر اساس روش UPGMA در 40 فرد از 10 جمعیت گونۀ
T. tomentosum. اطلاعات مربوط به جمعیت‌ها در جدول (1) آمده است.

جدول 4- آنالیز واریانس مولکولی (AMOVA) داده‌های حاصل از نشانگر مولکولی CDDP مربوط به 40 فرد از 10 جمعیت گونۀ
T. tomentosum

منابع تنوع

درجۀ آزادی

میانگین مربع‌ها

انحراف معیار

درصد تنوع

درون‌جمعیتی

30

00/532

733/17

%62

بین‌جمعیتی

9

700/545

725/10

%38

کل

39

700/1077

458/28

%100

 

 

برای تأیید و بررسی دقیق‌تر ارتباط بین و درون جمعیت‌ها از روش تجزیه به مختصات‌ اصلی (PCoA) استفاده شد که در شکل (3) نشان داده شده است. نتایج PCoA کاملاً با نتایج تجزیۀ خوشه‌ای مطابقت داشتند. محورهای اول و دوم به‌ترتیب 21/30 و 90/18 درصد واریانس کل را توجیه کردند. درصد تنوع محاسبه‌شده در هر محور اصلی در جدول (5) ارائه شده است. بر اساس نتایج، محورهای اصلی اول، دوم و سوم درمجموع 42/65 درصد کل تنوع را توجیه می‌کنند.

 

 

شکل 3- نمودار PCoA بر اساس تجزیه به مختصات اصلی حاصل از نرم‌افزار GenALEX در 40 فرد از 10 جمعیت (4 فرد از هر جمعیت) گونۀ T. tomentosum

 

 

جدول 5- درصد تنوع برای آغازگرهای CDDP محاسبه‌شده توسط سه محور اصلی در آنالیز PCoA

محور

1

2

3

درصد تنوع

21/30

90/18

32/16

درصد تجمعی تنوع

21/30

10/49

42/65

 

بیشترین تعداد آلل‌ مشاهده‌شده (Na) به جمعیت ch86 با 983/0 آلل و کمترین مقدار آن به جمعیت to114 با 607/0 آلل تعلق داشت. آلل‌های مؤثر (Ne) یعنی آلل‌هایی که دارای فراوانی برابر و توزیع خوبی هستند در جمعیت ch86 با 277/1 آلل بیشترین و در جمعیت to114 با 117/1 آلل کمترین مقدار را داشتند. میزان تنوع در جمعیت to86 با شاخص شانون (I) و شاخص نی (H) (230/0H= و156/0I=) بیش از سایر جمعیت‌ها بود. جمعیت‌های to86 و to114 به‌ترتیب دارای بیشترین و کمترین تنوع‌پذیری و میزان پراکندگی نسبت به سایر جمعیت‌ها بودند (جدول 6).

جدول 6- شاخص‌های تنوع ژنتیکی در 10 جمعیت از گونۀ
 T. tomentosum

جمعیت‌ها

Na

Ne

I

He

to15A

906/0

221/1

189/0

127/0

to81

795/0

201/1

161/0

111/0

to114

607/0

117/1

097/0

066/0

to 91

863/0

242/1

197/0

135/0

to H28

872/0

188/1

171/0

113/0

cu88A

812/0

175/1

146/0

099/0

ch77B

744/0

193/1

161/0

110/0

ch 17

897/0

195/1

165/0

112/0

cu 33

846/0

199/1

160/0

110/0

ch 86

983/0

277/1

230/0

156/0

میانگین

832/0

201/1

168/0

114/0

تعداد آلل‌های مشاهده‌شده (Na)، تعداد آلل‌های مؤثر (Ne)، شاخص تنوع ژنتیکی نی (H)، شاخص شانون (I)

 

در ارزیابی ماتریس فاصلۀ جمعیت‌های بررسی‌شده از گونۀ T. tomentosumکه با نرم‌افزار GenAlex انجام شد بیشترین شباهت با فاصلۀ 159/0 بین جمعیت ch17 از واریتۀ chthonocephalum و جمعیت cu33 از واریتۀ curvisepalum مشاهده شد و جمعیت‌ to15A از واریتۀ tomentosum و جمعیت ch77B از واریتۀ chthonocephalum با میزان فاصلۀ 098/1 بیشترین تفاوت را در بین جمعیت‌های بررسی‌شده نشان دادند.

 

بحث و نتیجه‌گیری

در پژوهش حاضر با استفاده از نشانگرهای CDDP تنوع بین و درون جمعیت‌های طبیعی گونۀ
T. tomentosum ارزیابی شد. نتایج چندشکلی درخور توجهی (29/98 درصد) را در الگوهای باندی به‌دست‌آمده نشان دادند.

از میان آغازگرهای آزموده‌شده، آغازگر KNOX-2 با 12 باند دارای بیشترین تعداد باند چندشکل بود. باندهای منحصر‌به‌فرد (اختصاصی) در آغازگرهای KNOX-1 و MADS-1 دیده شدند. با‌توجه‌به اهمیت باندهای اختصاصی در شناسایی تاکسون‌ها و نیز طراحی نشانگرهای جدید مبتنی بر ارتباط این باندها و صفت‌های اختصاصی تاکسون‌های درحال تفرق
(Roy, 2000) احتمالاً این دو آغازگر کارایی بیشتری در جداسازی تاکسون‌های این جنس نسبت به سایر آغازگرهای استفاده‌شده داشته‌اند.

شاخص قدرت تفکیک بهترین شاخص برای انتخاب آغازگر مناسب (Rp) است زیرا هم از تعداد افراد دارای باند و هم از تعداد آلل تأثیر می‌پذیرد (Prevost and Wilkinson, 1999). قدرت تفکیک (Rp) شاخصی است که توانایی تفکیک آغازگرهای انتخابی را نشان می‌دهد (Kayis et al., 2010). میزان Rp در آغازگر MADS-2 با 44/7 بیشترین مقدار را داشت و نشان می‌دهد این آغازگر نسبت به سایر آغازگرها دارای قدرت تفکیک بهتری است.

شاخص نشانگر (MI) برآورد مناسبی برای کارایی آغازگرها است که به تعداد باندهای چندشکل به‌دست‌آمده و به پوشش زیاد ژنوم توسط نشانگر نسبت داده می‌شود (Milbourne et al., 1997). زیادبودن شاخص نشانگر نشان‌دهنده تولید تعداد بیشتری باند چندشکل و فراهم‌کردن اطلاعات بیشتری از ژنوم است (Spooner et al., 2005). در پژوهش حاضر، بیشترین شاخص نشانگر (20/5) در آغازگر MADS-1 مشاهده شد که کارایی خوب این آغازگر نسبت به سایر آغازگرهای بررسی‌شده را نشان می‌دهد.

میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی (PIC) در پژوهش حاضر برابر با 39/0 محاسبه شد. PIC یکی از شاخص‌های مهم برای مقایسۀ قدرت تمایز نشانگرهای مختلف است. مقادیر زیاد این شاخص بر چندشکلی زیاد در یک جایگاه دلالت دارد که دارای نقش بسزایی در تفکیک و تمایز افراد است (Thimmappaiah et al., 2008). بیشترین مقدار میانگین محتوای اطلاعات چندشکلی در پژوهش حاضر به آغازگر MADS-1 با مقدار 52/0 و کمترین آن به آغازگر ERF-2 با مقدار 25/0 مربوط بود. مقادیر PIC از صفر تا یک متغیر هستند و هر چه اعداد به‌دست‌آمده بیشتر باشند بیان‌کنندۀ فراوانی بیشتر چندشکلی برای آن جایگاه در نمونه‌های بررسی‌شده هستند (Wei et al., 2005)؛ پس آغازگر MADS-1 با بیشترین مقدار PIC سطح تمایز بالاتری نسبت به سایر آغازگرهای بررسی‌شده دارد و توانایی آن در آشکارسازی چندشکلی بیشتر است؛ در حالی که آغازگر ERF-2 با کمترین مقدار PIC (25/0) سهم کمتری در جداسازی تاکسون‌ها دارد. طبق نظر Botstein و همکاران (1980) 5/0˃PIC نشان‌دهندۀ نشانگر بسیار کارآمد و 25/0˃PIC>5/0 نشان‌دهندۀ نشانگر کارا و 25/0˂PIC نشان‌دهندۀ نشانگر دارای کارایی کم است. در پژوهش حاضر، مقدار PIC بین 25/0 و 52/0 و به‌طور میانگین برابر با 39/0 بود و با‌توجه‌به نظر Botstein (1980) نشانگرهای CDDP در مطالعۀ حاضر کارا بودند.

نتایج پژوهش حاضر و میزان زیاد چندشکلی (29/98 درصد) باند‌های حاصل از نشانگرهای CDDP نشان می‌دهند این روش برای مطالعه‌های تاکسونومیک و فیلوژنتیک در جنس Trifolium مناسب است. همچنین جمع‌بندی نتایج نشان می‌دهد نقش آغازگر MADS-1 در جداسازی افراد بررسی‌شده بیش از سایر آغازگرها است.

خوشه‌بندی حاصل از دندروگرام نشان می‌دهد واریته‌های curvisepalum و chthonocephalum باهم در خوشۀ دوم دسته‌بندی می‌شوند و واریتۀ tomentosum به‌طور جداگانه در خوشۀ اول قرار می‌گیرد؛ درحالی‌که بر اساس مطالعه‌های پیشین با استفاده از نشانگرهای IRAP و SSR، واریته‌های tomentosum و curvisepalum باهم در یک گروه دسته‌بندی می‌شوند و واریتۀ chthonocephalum به‌طور جداگانه دسته‌بندی می‌شود (Haerinasab, 2012)؛ ازاین‌رو، واریته‌های این گونه شبیه‌تر از آن هستند که به کمک این نشانگرها تفکیک شوند.

برای تأیید و بررسی دقیق‌تر ارتباط بین و درون جمعیت‌ها از تجزیه به مختصات اصلی (PCoA) استفاده شد. نتایج PCoA با نتایج تجزیۀ خوشه‌ای بر اساس روش UPGMA مطابقت داشتند و دو دستۀ مجزا کاملاً مشهود بودند. دستۀ اول شامل واریتۀ tomentosum و دستۀ دوم شامل واریته‌های curvisepalum و chthonocephalum بود که مؤید ارتباط نزدیک‌تر دو واریتۀ curvisepalum و chthonocephalum است.

نتایج واریانس مولکولی نشان دادند از میزان کل واریانس مشاهده‌شده، 38 درصد به تنوع بین جمعیت‌ها و 62 درصد به تنوع درون جمعیت‌ها مربوط است. Taylor و Gillett (1988) از بین گونه‌های یک‌سالۀ بخش fragifera گونۀ T. tomentosum را خودلقاح دانستند. با‌توجه‌به مقدار بیشتر تنوع درون جمعیتی (62 درصد) نسبت به تنوع بین جمعیتی (38 درصد) در آنالیز واریانس مولکولی به نظر می‌رسد برخلاف نظر Taylor و Gillett (1988)، گونۀ T. tomentosum مشابه گونه‌های T. resupinatum و T. clusii دگرلقاح باشد (Taylor and Gillett, 1988).

در بررسی تنوع ژنتیکی از طریق داده‌های مولکولی بهتر است آغازگرها توزیع یکنواخت و مناسبی در سطح ژنوم داشته باشند تا درحدممکن کل ژنوم را پوشش دهند؛ بنابراین، اگر آغازگرها از بخش‌های مختلف ژنوم انتخاب شده باشد همبستگی بین نتایج کم خواهد بود و تعداد محور بیشتری برای توجیه تنوعات آنها نیاز است (Hedrick, 2011). نتایج تجزیه به مختصات اصلی نشان دادند آغازگرهای استفاده‌شده در پژوهش حاضر تاحدی کل ژنوم را پوشش می‌دهند؛ زیرا بر پایۀ نتایج، محورهای اصلی اول، دوم و سوم درمجموع 42/65 درصد کل تنوع را توجیه می‌کنند که بر توزیع مناسب آغازگرها در ژنوم دلالت دارد.

نتایج بررسی حاضر تنوع ژنتیکی نسبتاً مطلوب بین جمعیت‌های مطالعه‌شده را نشان می‌دهند. بر اساس نتایج، شاخص نی 114/0 درصد و شاخص شانون 168/0 درصد ارزیابی شد. بررسی تنوع در جمعیت‌های حاضر با نشانگرهای CDDP نشان داد بیشترین تشابه ژنتیکی بین جمعیت‌های ch17 از واریتۀ chthonocephalum و cu33 از واریتۀ curvisepalum است و به‌علت همین تشابه ژنتیکی بیشتر، این دو جمعیت در یک خوشۀ دندروگرام تجزیۀ خوشه‌ای قرار می‌گیرند. تشابه ژنتیکی بین جمعیت‌های یادشده و قرارگرفتن آنها در یک گروه از نزدیک‌بودن زمان پیدایش، مبدأ پراکنش یکسان و قرابت‌های ژنتیکی این واریته‌ها ناشی می‌شود.

بیشترین فاصلۀ ژنتیکی بین جمعیت‌ to15A از واریتۀ tomentosum و جمعیت ch77B از واریتۀ chthonocephalum دیده شد و به‌علت همین تفاوت ژنتیکی، دو جمعیت در دو خوشۀ متفاوت دندروگرام تجزیۀ خوشه‌ای بر اساس روش UPGMA قرار گرفتند.

به‌طور‌کلی، بر اساس نتایج به‌کارگیری روش CDDP واریته‌های curvisepalum و chthonocephalum به هم شبیه‌ترند و واریته‌های tomentosum و chthonocephalum شباهت و نزدیکی کمتری دارند. نتیجۀ یادشده با نتایج مطالعه‌های پیشین مبنی بر نشانگرهای IRAP و SSR همخوانی ندارد و ازاین‌رو، نشانگرهای مولکولی به‌کاررفته باوجود چندشکلی زیاد اغلب گزینۀ مناسبی برای مطالعه‌های فروگونه‌ای در گونۀ T. tomentosum و احتمالاً در سایر گونه‌های جنس Trifolium نیستند.

 

سپاسگزاری

نویسنده از حمایت‌های مالی دانشگاه پیام نور تشکر می‌کند. مقالۀ حاضر از نتایج طرح پژوهش اجراشده به شماره قرارداد 8666/035/03 برگرفته شده است.

 

Avise, J. C. (1994) Molecular Markers, Natural History and Evolution. Chapman and Hall, New York.

Belletti, P., Monteleone, I. and Ferrazzini, D. (2008) A population genetic study in a scattered forest species, Wild service tree [Sorbus torminalis (L.) crantz], using RAPD marker. European Journal of Forest Research 127: 103-114.

Botstein, D., White, R. L., Skolnick, M. and Davis, R. W. (1980) Construction of genetic linkage map in man using restriction length polymorphisms. American Journal of Human Genetics 32: 314-331.

Collard, B. C. Y. and Mackill, D. J. (2009) Conserved DNA-Derived Polymorphism (CDDP): A Simple and novel method for generating DNA markers in plants. Plant Molecular BiologyReporter 27(4): 558-562

Haerinasab, M. (2012) Genetic diversity and interspecific relationships studies among the species of the genus Trifolium L. section Fragifera Koch (Vesicaria Crantz) in Iran. PhD thesis, University of Isfahan, Isfahan, Iran (in Persian).

Haerinasab, M. and Rahiminejad, M. R. (2012) A taxonomic revision of the genus Trifolium L. sect. Fragifera Koch (Fabaceae) in Iran. Iranian Journal of Botany 18(1): 22-30.

Hajibarat, Z., Saidi, A., Hajibarat, Z. and Talebi, R. (2015) Characterization of genetic diversity in chickpea using SSR markers, start codon targeted polymorphism (SCoT) and conserved DNA-derived polymorphism (CDDP).Physiology and Molecular Biology of Plants 21(3): 365-373.

Hedrick, P. W. (2011) Genetics of populations. Jones and Bartlett Learning, United states of America.

Heller, D. (1984) Trifolium. In: Flora Iranica (Ed. Rechinger, K. H.) vol. 157. Akademische Druck-U Verlagsanstalt, Graz.

Kayis, S. A., Hakki, E. E. and Pinarkara, E. (2010) Comparison of effectiveness of ISSR and RAPD markers in genetic characterization of seized marijuana (Cannabis sativa L.) in Turkey. African Journal of Agricultural Research 5(21): 2925-2933

Lefort, F. and Douglas, G. C. (1999) An eYcient micro-method of DNA isolation from mature leaves of four hardwood tree species Acer, Fraxinus, Prunus and Quercus. Annals of Forest Science 56: 259-263.

Li, T., Li, Y., Ning, H., Sun, X. and Zheng, C. (2013) Genetic diversity assessment of chrysanthemum germplasm using conserved DNA-derived polymorphism markers. Scientia Horticulturae 162: 271-277.

Marticorena, C. and Quezada, M. (1985) Catálogo de la Flora Vascular de Chile. Gayana Botánica 42: 1-157.

Milbourne, D., Meyer, R., Bradshaw, J. E., Baird, E., Bonar, N., Provan, J., Powell, W. and Waugh, R. (1997) Comparison of PCR-based marker systems for the analysis of genetic relationships in cultivated potato. Molecular Breeding 3: 127-136.

Nie, M. (1973) Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 70(12): 3321-3323.   

Pawell, W., Morganet, M., Andre, C., Hanafey, M., vogel, J., Tingey, S. and Rafalaski, A. (1996) The comparision of RFLP, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Molecular Breeding 2: 225-238.

Poczai, P., Varga, I., Bell, N. E. and Hyvönen, J. (2011) Genetic diversity assessment of bittersweet (Solanum dulcamara, Solanaceae) germplasm using conserved DNA-derived polymorphism and intron-targeting markers. Annals of Applied Biology 159: 141-153.

Poczai, P., Varga, I., Laos, M., Cseh, A., Bell, N., Valkonen, J. P. T. and Poczai J. H. (2013) Advances in plant gene-targeted and functional markers: a review. Plant Methods 9: 6.

Prevost, A. and Wilkinson, M. J. (1999) A new system for comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. Theoretical and Applied Genetics 98: 107-112.

Roy, D. (2000) Plant breeding: Analysis and exploitation of variation. Alpha Science International Ltd, India.

Spooner, D., van Treuren, R. and de Vicente, M. C. (2005) Molecular markers for genebank management. IPGRI Technical Bulletin No. 10. Plant Genetic Resources Institute (now Bioversity International, Inc.), Rome.

Taylor, N. L. and Gillett, J. M. (1988) Crossing and morphological relationships among Trifolium species closely related to strawberry and persian clover. Crop Science 28: 636-639.

Thimmappaiah, W., Santhosh, G., Shobha, D. and Melwyn, G. S. (2008) Assessment of genetic diversity in cashew germplasm using RAPD and ISSR markers. Scientia Horticulturae 118: 1-7.

Wei, Y. M., Hou, Y. C., Yan, Z. H., Wu, W., Zhang, Z. Q., Liu, D. C. and Zhang, Y. L. (2005) Microsatellite DNA polymorphism divergence in Chinese wheat landraces highly resistant to Fusarium head blight. Theoretical and Applied Genetics 46: 3-9.

Zohary, M. and Heller, D. (1970) The Trifolium species of Sect. Vesicaria Crantz. Israel Journal of Botany 19: 314-335.

Zohary, M. and Heller, D. (1984) The genus Trifolium. The Israel Academy of Science Humanities, Jerusalem.