جداسازی و شناسایی آرکی‌های نمک‌دوست اجباری قابل کشت تالاب پُر شور اینچه‌برون، استان گلستان

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 بخش میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، تهران، ایران بانک میکروارگانیسم‌ها، مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران، جهاد دانشگاهی، کرج، ایران

2 بخش میکروبیولوژی، دانشکده زیست‌شناسی وقطب تبارزایی موجودات زنده، پردیس علوم، دانشگاه تهران، تهران، ایران

3 بخش میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، تهران، ایران

چکیده

تنوع آرکی‌های نمک‌دوست تالاب اینچه‌برون واقع در استان گلستان ایران با روش‌های مبتنی بر کشت بررسی شد. نمونه‌برداری در دو فصل پُر بارش و کم بارش (اردیبهشت‌ و شهریورماه 1389) انجام گرفت. در هر نمونه‌برداری چهار منطقه مشخص از تالاب با استفاده از محیط‌های پیچیده نظیر MGM، JCM168، MH1 و یک محیط قلیایی حاوی 23 درصد نمک بررسی شد. پس از گرماگذاری (incubation) در دمای 40 درجه سانتیگراد، 406 جدایه به دست آمد. متوسط تعداد کلونی‌های به دست آمده در روش کشت، CFU/ml 106×1/2 بود. 361 جدایه از محیط MGM، 39 جدایه از محیط JCM168، سه جدایه از محیط MH1 و سه جدایه از محیط قلیایی به دست آمد. تعدادی از ویژگی‌های ریخت‌شناسی، بیوشمیایی و فیزیولوژیکی اولیه برای این سویه‌ها بررسی شد و از میان این جدایه‌ها، 45 سویه بر اساس صفات بررسی شده انتخاب و با تکثیر و تعیین ترادف ژن 16S rRNA شناسایی شدند. از این تعداد 40 سویه به خانواده Halobacteriaceae جنس‌های Haloarcula، Halorubrum، Haloferax، Halobellus، Halogeometricum، Halobacterium، Halolamina، Halorhabdus و Halostagnicola (به ترتیب: 30، 5/27، 5/17، 10، 2/5، 6/2، 6/2، 6/2 و 6/2 جدایه‌های مربوط به قلمرو آرکی‌ها) تعلق داشتند و پنج سویه به سلسله باکتری‌ها، جنس‌های Rhodovibrio، Pseudomonas و Salicola (به ترتیب 40، 40 و 20 درصد سویه‌های باکتریایی) متعلق بودند. با توجه به تعداد محدود جنس‌های آرکی نمک‌دوست شناسایی شده در جهان، بررسی‌ها بیانگر تنوع نسبتاً بالای آرکی‌های نمک‌دوست قابل کشت در این تالاب است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and identification of culturable extremely halophilic archaea of Inche-Boroun wetland

نویسندگان [English]

  • Mehrnoosh Rasooli 1
  • Mohammad Ali Amoozegar 2
  • Abbas Akhavan Sepahy 3
1 Department of Microbiology, Faculty of Biology Sciences, Islamic Azad University North Tehran Branch, Tehran, Iran Microorganisms Bank, Irananian Biological Resource Centre, Karaj, Iran
2 Department of Microbiology, Center of excellence in Phylogeny of Living Organisms, College of Sciences, University of Tehran, Tehran, Iran
3 Department of Microbiology, Faculty of Biology Sciences, Islamic Azad University North Tehran Branch, Tehran, Iran
چکیده [English]

Haloarchaeal diversity of Inche-Boroun wetland in north of Iran in Golestan province was investigated by using culture-dependent methods. Sampling was carried out in May and September 2010. In each sampling, 4 distinct region of wetland were analyzed by using complex media like MGM, JCM168, MH1 and an alkaliphilic medium containing 23% salts. After incubation at 40ºC, a total of 406 isolates were prepared and 2.1×106 CFU/ml were obtained in culture media. Among all isolates, 361 isolates were obtained from MGM and 39 isolates from JCM 168, 3 isolates from MH1 and 3 isolate from alkaliphilic media. Initial morphological, biochemical and physiological tests were performed. According to the results, 45 isolates were selected and phylogenetic analysis of 16S rRNA was performed for them. Among selected strains, 40 isolates belonged to Halobacteriacaea and were related to Haloarcula,Halorubrum, Haloferax, Halobellus, Halogeometricum, Halobacterium, Halolamina, Halorhabdus and Halostagnicola (respectively 30, 27.5, 17.5, 10, 5.2, 2.6, 2.6, 2.6 and 2.6 percent of Haloarchaeal strains). A total of 5 strains belonged to the kingdom of Bacteria and were related to Rhodovibrio, Pseudomonas and Salicola (respectively 40, 40 and 20 percent of bacterial strains). According to our results and the limited numbers of haloarchaeal genera that having been discovered until now, it seemed that the culturable prokaryotic populations in this hypersaline environment was diverse.

کلیدواژه‌ها [English]

  • halophilic archaea
  • Biodiversity
  • 16S rRNA gene

مقدمه

محیط‌های پُر شور مانند حوضچه‌های استحصال نمک و دریاچه‌های شور طبیعی، بوم نظام‌های (اکوسیستم)‌ نسبتاً ساده با تنوع پایین و تراکم جمعیت بالا را در اختیار بوم‌شناسان قرار می‌دهند. انواع متفاوت میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست مشکل سازگاری با تنش شوری زیاد (و سایر انواع تنش) را به طرق مختلف حل نموده‌اند. بنابراین، مطالعه حیات میکروبی در غلظت‌های بالای نمک، می‌تواند پاسخگوی بسیاری از پرسش‌های اساسی درباره سازگاری میکروارگانیسم‌ها با محیط‌هایشان باشد (Ma et al., 2010). دریاچه‌های نمک و نمک‌های تولید شده از این دریاچه‌ها حاوی تعداد زیادی آرکی‌های نمک‌دوست اجباری خانواده Halobacteriaceaeهستند. در چنین محیط‌هایی تعداد 107-108 واحد تشکیل‌دهنده کلونی در هر میلی‌لیتر آب غیر طبیعی نیست. همچنین، نمک های غیر فرآوری شده این دریاچه‌ها اغلب حاوی 105-106 واحد تشکیل‌دهنده کلونی در هر گرم هستند. اعضای خانواده Halobacteriaceae،میکروارگانیسم‌های غالب محیط‌های پُر شور سراسر جهان شامل دریاچه‌های نمک، حوضچه‌های استحصال نمک، معادن نمک و همچنین دریاچه‌های پُر شور قلیایی هستند (Birbir et al., 2007).

میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست به دلیل توانایی زندگی در محیط شور، در زمینه‌های مختلف زیست‌فناوری دارای توانمندی‌های بالقوه و بالفعل بسیاری هستند. تولید پلیمرهای زیستی مانند: بیوسورفاکتانت‌ها و اگزو پلی‌ساکاریدها (که سبب افزایش بازیافت نفت می‌شوند) و همچنین آنزیم‌های مختلف مثل ایزومرازها و هیدرولازها از کاربردهای این میکروارگانیسم‌ها است. از این دست پژوهش‌های انجام شده در ایران می‌توان به تولید آمیلاز خارج سلولی تحت تنش حرارت و شوری بالا توسط باکتری Halobacillus sp. Strain MA-2 (Amoozegar et al., 2003)، ارزیابی احیای کروم توسط باکتری نمک‌دوست نسبی مقاوم به کرومات Nesterenkonia sp. Strain MF2 (Amoozegar et al., 2007)، غربالگری و جداسازی باکتری‌های نمک‌دوست تولید‌کننده هیدرولازهای خارج سلولی از دریاچه نمک حوض سلطان (Rohban et al., 2009) اشاره نمود.

ایران از نظر وجود محیط‌های پُر شور به ویژه دریاچه‌ها و تالاب‌های پر شور از تنوع بسیار بالایی برخوردار است. در سال‌های اخیر تمایل بسیار زیادی به بررسی دریاچه‌های پُر شور ایران نشان داده شده است که حاکی از اهمیت این محیط‌ها به عنوان گنجینه‌ای مهم از ذخایر زیستی و ژنتیکی کشور است. تالاب نمک اینچه‌برون نیز به عنوان گوشه‌ای از این اکوسیستم منحصر به فرد، محل مناسبی برای بررسی تنوع میکروارگانیسم‌ها به ویژه میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست اجباری، نسبی و تحمل‌کننده نمک است. این تالاب، در سمت راست مسیر جاده‌ آق قلا به اینچه‌برون و در 26 کیلومتری شمال آق قلا، در 54 درجه و 51 دقیقه طول شرقی و 37 درجه و 8 دقیقه و 57 ثانیه عرض شمالی واقع شده است.

نمونه‌برداری از این تالاب در دو فصل پُر بارش و کم بارش با هدف بررسی تغییر ترکیب جمعیت میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست اجباری موجود در این منطقه انجام گرفت. مطالعه اخیر، نخستین بررسی در زمینه‌ تنوع زیستی تالاب اینچه‌برون به عنوان محیطی منحصر به فرد با هدف بررسی گوناگونی و شناسایی آرکی‌های نمک‌دوست ساکن و تعیین نقشه زیستی این دریاچه است.


 

 

مواد و روش‌ها


نمونه‌برداری و جداسازی میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست اجباری

برای جداسازی سویه‌های نمک‌دوست افراطی از خاک، لجن‌های نمکی، آب‌های شور رنگی و کریستال‌های سفید و رنگی نمک در دو فصل پُر بارش و کم بارش (اردیبهشت‌ماه و شهریور‌ماه 1389) از چهار منطقه تالاب نمونه‌برداری صورت گرفت. موقعیت جغرافیایی دقیق مناطق نمونه‌برداری با GPS ثبت و علامت‌گذاری شد (شکل 1).

 

 

شکل 1- موقعیت جغرافیایی تالاب اینچه‌برون و مناطق نمونه‌برداری در نقشه گوگل

 

 

نمونه‌های جمع‌آوری شده از هر محل در کیسه‌های پلاستیکی و فالکون‌های استریل به آزمایشگاه منتقل شد. دما و pH نمونه‌ها در محل نمونه‌برداری با دماسنج و pH متر قابل حمل در محل اندازه‌گیری و ثبت شد. نمونه‌ها در دمای محیط و در کمترین زمان ممکن به آزمایشگاه منتقل و شوری نمونه‌ها با دستگاه مالتی‌متر دیجیتال اندازه‌گیری شد.

تحلیل شیمیایی نمک تالاب برای سنجش عناصر شیمیایی موجود در محیط‌زیست تالاب در دو نوبت نمونه‌برداری، توسط شرکت خاک بهین‌آزما صورت گرفت.

برای جداسازی آرکی‌ها و باکتری‌های نمک‌دوست اجباری از نمونه‌های جمع‌آوری شده از محیط‌های کشت زیر استفاده شد:

1- محیط‌کشت MGM23% (pH 7.2-7.3) با ترکیبات (گرم در لیتر):

.NaCl, 184; MgCl2 6H2O, 23; MgSO4 7H2O, .26.8; KCl, 5.3; CaCl2, 0.8; Peptone,10; Yeast .extract, 2; Distilled water, 1000ml (Dyall-.Smith, 2008).

2- محیط‌کشت JCM 168 (pH 5.2) با ترکیبات (گرم در لیتر):

.NaCl, 200; Sodium Glutamate, 1; Trisodium .Citrate, 3; MgSO4.7H2O, 20; KCl, 2; .FeCl2.4H2O, 0.0036mg; MnCl2.4H2O, .0.00036; Yeast extracts, 5; Casamino acids, 5; .Agar, 20; Distilled water, 1000ml (Minegishi .et al., 2009).

3- محیط‌کشت MH1 (pH 5.2) با ترکیبات (گرم در لیتر):

.NaCl, 200; L-Glutamic acid, 2; Trisodium .Citrate, 2; K2SO4, 5; MgCl2.6H2O, 1; NH4Cl, .1; FeSO4.7H2O, 0.004; Yeast extracts, 2; .Casamino acids, 5; Agar, 20; Distilled water, .1000ml (Minegishi et al., 2008)..

4- محیط‌کشت قلیایی (pH 9.2) با ترکیبات (گرم در لیتر):

.NaCl, 200; KH2PO4, 1; MgSO4.7H2O, 0.2; .Na2CO3, 18; Casamino Acids, 5; Agar, 20; .Distilled water, 1000ml (Dyall-Smith, 2008).

برای افزایش pH این محیط به دلیل بالا بودن میزان یون‌های منیزیم در محیط و ایجاد رسوب در محیط به جای ترکیب NaOH از ترکیب Na2CO3 استفاده شد که پس از اتوکلاو به صورت جداگانه به محیط افزوده شد.

برای جداسازی و کشت آرکی‌های نمک‌دوست از نمونه‌های خاک، لجن و رسوبات سری رقت متوالی تهیه شد و برای کشت نمونه‌های آب به دلیل تراکم پایین آرکی‌ها، پس از سانتریفیوژ مقداری از نمونه‌ها از مخلوط رسوب و مایع زیرین برای کشت در محیط‌های فوق استفاده شد. همچنین، حدود 500 میلی‌لیتر از آب هر منطقه پس از صاف کردن با فیلتر 22/0 میکرون فیلتر شد، سپس فیلتر روی محیط‌های کشت مربوط قرار داده شد. پلیت‌ها به مدت یک هفته در گرمخانه 40 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد و سپس تا مدت 6 ماه هر دو هفته یکبار از نظر وجود کلونی‌های جدید و کُند رشد بررسی شد.

کلونی‌هایی با لام گرم متفاوت یا ریخت‌شناسی متفاوت کلونی از پلیت‌های اولیه جداسازی و مجدداً کشت داده شد. برای نگهداری و تجدید کشت سویه‌ها از محیط‌های استفاده شده برای جداسازی سویه‌ها در مراحل اولیه استفاده و در یخچال 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.

برای اندازه‌گیری تعداد میکروارگانیسم‌ها در نمونه‌ها، تعداد کلونی‌ها در پلیت‌های اولیه در رقت‌های متفاوت نمونه‌های آب شمارش شد.

برای جداسازی جدایه‌های نمک‌دوست اجباری و غیر اجباری، جدایه‌ها در محیط‌های کشت جداسازی حاوی 5 درصد نمک کشت داده شد. جدایه‌هایی که قادر به رشد در مقادیر بالاتر از 5 درصد نمک بودند به عنوان جدایه‌های نمک‌دوست اجباری در نظر گرفته شدند.

بررسی ویژگی‌های ریخت‌شناسی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک: سویه‌های نمک‌دوست از نظر بعضی صفات و ویژگی‌های ریخت‌شناسی، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی مطالعه شدند. رنگ‌آمیزی گرم بر اساس روش Dussault (1955) انجام شد. برای سنجش بهینه و محدوده رشد سویه‌ها از محیط‌های جامد و مایع MGM با درصدهای NaCl برابر با 5، 10، 15، 20، 25 و 30 استفاده شد. بررسی حرکت از طریق روش‌های لام مرطوب انجام شد .(Gerhardt et al., 1994) فعالیت پراکسیدازی در حضور محلول 3 درصد پراکسید هیدروژن تعیین شد. فعالیت اکسیدازی با استفاده از دیسک‌های اکسیداز آماده (شرکت Himedia) تعیین شد.

استفاده از آنتی‌بیوتیک‌های خاص می‌تواند در تفکیک آرکی‌ها از باکتری‌ها مؤثر باشد، بر این اساس آزمون آنتی‌بیوگرام برای سویه‌ها با استفاده از دیسک آنتی‌بیوتیک‌هایی نظیر کلرامفنیکل، تتراسیکلین، اریترومایسین، نووبیوسین، باسیتراسین، پنی‌سیلین G و نیتروفورانتوئین انجام شد.

شناسایی فیلوژنتیک سویه‌های منتخب: برای شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن 16S rRNA در سویه‌های منتخب، سویه‌های نمک‌دوست اجباری از نظر ویژگی‌های بررسی شده دسته‌بندی شد و تعداد 45 سویه به صورت تصادفی برای مطالعات فیلوژنتیکی انتخاب شد.

برای استخراج DNA از روش Wanlam (Dyall-Smith, 2008) و روش تغییر یافته Marmur (1961) استفاده شد. برای تأیید استخراج انجام شده، الکتروفورز ژل آگاروز بر اساس روش پیشنهاد شده توسط Kolmodin و Williams در سال 1997 صورت گرفت.

از جفت پرایمر عمومی 21F با ترادف:

5´-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3´ .

و 1492R با ترادف:

5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3´ .

برای آرکی‌ها و از جفت پرایمر عمومی27F با ترادف:

5´-AGAGTTTGATCMTGGGTCAG-3´ .

و 1492R برای باکتری‌ها استفاده شد(Jiang et al., 2006).

غلظت مواد به کار رفته در تهیه مخلوط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای حجم واکنش 50 میکرو لیتر به این صورت است:

.PCR buffer (10X), 5μl; MgCl2 (5mM), 1.5ml; .dNTP mix (10mM), 1ml; Primers (10mM .each), 2ml; Taq DNA polymerase, 0.25ml; .Template DNA, 2-4ml; Sterilized distilled .water, 34-38ml

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز برای سویه‌های آرکی به این روش صورت گرفت: دناتوراسیون اولیه برای مدت 3 دقیقه در ˚C 94 انجام گرفت. سپس، چرخه تکثیر آغاز شد که شامل 30 سیکل تکرار شونده با دمای دناتوراسیون ˚C94 به مدت 15 ثانیه، دمای اتصال
˚C 51 به مدت 30 ثانیه و دمای سنتز ˚C 72 به مدت 60 ثانیه بود. برای سویه‌های باکتریایی دناتوراسیون اولیه به مدت 2 دقیقه در ˚C 94 انجام شد. به دنبال آن چرخه تکثیر آغاز شد که شامل 30 سیکل تکرار شونده با دمای دناتوراسیون ˚C 94 به مدت 60 ثانیه، دمای اتصال ˚C 55 به مدت 60 ثانیه و دمای سنتز ˚C 72 به مدت 60 ثانیه بود. در نهایت، پس از اتمام چرخه‌ها و به منظور تکمیل نهایی ساختارهای تکثیر شده نمونه‌ها به مدت 7 دقیقه در دمای ˚C 72 قرار داده شد. به دلیل متفاوت بودن سویه‌ها دمای اتصال هر سویه با استفاده از دستگاه PCR گرادیان بهینه‌سازی شد. برای بررسی صحت PCR و تأیید دستیابی به باند 16S rRNA جدایه‌های مورد نظر الکتروفورز انجام شد. 5 ماکرو لیتر از محصول PCR به همراه شاهد مثبت و منفی PCR و شاخص وزن مولکولی با طیف bp10000-100 روی ژل آگاروز 1 درصد تحلیل شد. خالص‌سازی و تعیین توالی نسبی محصول PCR توسط شرکت کره‌ای Macrogen به واسطه شرکت ژن فن‌آوران انجام شد. توالی‌های به دست آمده با نرم‌افزارهای Chromas و Chromas Pro مرتب و با توالی‌های ثبت شده در پایگاه اطلاعات ژنومی EzTaxon مقایسه شد. به این ترتیب، نزدیک‌ترین سویه‌ها با ترادف 16S rRNA مشابه با سویه‌های منتخب تعیین شد. انطباق توالی‌ها با نرم‌افزار ClustalX (ویرایش دوم) انجام شد. ارتباط فیلوژنتیکی توالی‌های به دست آمده با یکدیگر و دیگر سویه‌ها- توالی‌های مرتبط به دست آمده حاصل از جستجو- در پایگاه‌های اطلاعاتی Genbank و Eztaxon با نرم‌افزار MEGA نسخه 0/5 (Kumar et al., 2008) بررسی شد. در دسته‌بندی توالی‌ها از الگوی Maximum likelihood و Neighbour-joining .(Saitou and Nei, 1987) استفاده شد. بررسی اعتبار شاخه‌های درخت با الگوریتم بوت‌استرپ و با 100 بار نمونه‌گیری صورت گرفت (Felsenstein, 1985).

 

نتایج

نمونه‌برداری و جداسازی: انتخاب مناطق نمونه‌برداری بر اساس ویژگی‌های ظاهری تالاب انجام شد و بر این اساس تالاب به دو ناحیه اصلی تقسیم و در هر ناحیه دو منطقه انتخاب شد. در مناطق 1 و 4 دریاچه (به ویژه در فصل کم بارش) شورابه و نمک با رنگ‌های نارنجی، قرمز و سیاه غالب بود و در مناطق 2 و 3 بیشتر آب و قشر نمکی سفید رنگ قابل مشاهده بود که در برخی از مناطق با رگه‌های سیاه و صورتی همراه بود. جدول 1 ویژگی‌های مناطق نمونه‌برداری و تعداد سویه‌های انتخاب شده از هر منطقه را به تفکیک نوع نمونه را نشان می‌دهد. دمای مناطق 1 و 4 مشابه یکدیگر و بیشتر از سایر مناطق بود. شوری آب هر یک از مناطق در نوبت دوم نمونه‌برداری نسبت به نوبت اول بیش از 5/1 برابر افزایش داشت.

نتایج آنالیز شیمیایی در جدول 2 نشان داده شده است. از کاتیون‌ها، سدیم و از آنیون‌ها، کلر بیشترین مقدار را داشت. بنابراین، می‌توان تالاب اینچه‌برون را به عنوان محیطی با منشأ دریایی (thalassohaline) در نظر گرفت.

از نمونه‌های جمع‌آوری شده از گل، لجن، شورابه‌های رنگی و رسوبات در مجموع 406 جدایه به دست آمد. فراوانی تعداد جدایه‌ها به تفکیک مناطق نمونه‌برداری در شکل 2 نشان داده شده است.

در نمونه‌برداری اول 229 جدایه به دست آمد که 21 جدایه از محیط JCM، 205 جدایه از محیط MGM، دو جدایه از محیط MH1 و یک جدایه از محیط قلیایی جداسازی شد. در نمونه‌برداری دوم نیز 177 جدایه به دست آمد که 18 جدایه از محیط JCM، 156 جدایه از محیط MGM، یک جدایه از محیط MH1 و دو جدایه از محیط قلیایی به دست آمد. جدایه‌های به دست آمده از محیط‌های قلیایی و اسیدی در محیط MGM کشت داده شد که تمام جدایه‌های حاصل از محیط‌های اسیدی و قلیایی توانایی رشد در محیط MGM با pH خنثی را دارا بودند.

سویه‌های نمک‌دوست حاصل از دو نمونه‌برداری، در محیط جداسازی اولیه هر سویه که حاوی 5 درصد نمک تام بود کشت داده شدند. 18 سویه توانایی رشد در محیط 5 درصد را داشتند. با توجه به این که هدف، جداسازی میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست اجباری بود، این سویه‌ها در مراحل انتخاب سویه حذف شده، در نظر گرفته نشدند. بیشترین تعداد سویه‌ها از منطقه 1 با تعداد 108 سویه در نوبت اول و 70 سویه در نوبت دوم به دست آمده است، کمترین جداسازی نیز از منطقه 4 با تعداد 10 سویه در نوبت اول و 57 سویه در نوبت دوم انجام شده است.


 

 

جدول 1- تعداد سویه‌های انتخاب شده از هر منطقه به تفکیک نوع نمونه و ویژگی‌های مناطق در دو نوبت نمونه‌برداری

منطقه

نمونه‌برداری

مختصات

جغرافیایی

نوع نمونه

شوری

نوبت اول

(g/l)

شوری

نوبت دوم (g/l)

دمای متوسط

(˚C)

pH

آب

نمک

خاک

لجن و گل

1

N 37˚,13,438
E 054, 30, 224

2

0

7

22

177

4/286

39

3/4

2

N 37˚, 13, 932
E 054, 30, 081

0

0

0

3

7/176

287

8/31

2/5

3

N 37˚, 13,829
E 054, 30, 307

1

2

0

0

168

6/283

30

2/5

4

N 37˚, 13, 517
E 059, 30, 657

2

0

1

4

8/159

6/232

39

4/6

 

 

جدول 2- نتایج آنالیز شیمیایی نمونه‌های آب در دو نوبت نمونه‌برداری

نوع آزمایش

غلظت (mg/ l)

در نوبت اول

غلظت (mg/ l)

در نوبت دوم

Cl-

134748

145386

SO42-

7/1444

1/7824

Mg2+

4/40

25/7054

Na+

56120

49/60774

Fe2+

16/0

31/96

K+

6/27

81/153

 

 

شکل 2- فراوانی تعداد جدایه‌ها به تفکیک مناطق نمونه‌برداری

 

مشاهده لام‌های میکروسکوپی و رنگ‌آمیزی گرم نشان داد که از سویه‌های به دست آمده تعداد 33 سویه باسیل و 373 سویه دارای اشکال بی‌قاعده و چند شکل (پُلی‌مورف) بودند. همچنین، 402 سویه گرم منفی و تنها 4 سویه گرم مثبت رنگ گرفتند که در مورد سویه‌های باکتریایی، آزمون KOH (3 درصد) این نتایج را تأیید کرد. آزمون کاتالاز و اکسیداز برای تمام سویه‌ها انجام شد، تمام سویه‌ها کاتالاز مثبت بودند و تنها در تعدادی از سویه‌ها واکنش کاتالاز به صورت ضعیف‌تری مثبت بود. واکنش اکسیداز نیز برای 98 سویه منفی و برای سایر سویه‌ها مثبت بود. آزمون حرکت نیز برای تمام سویه‌ها انجام شد که 45 سویه متحرک و بقیه غیر‌متحرک بودند. آنتی‌بیوگرام برای 130 سویه، با آنتی‌بیوتیک‌های نووبیوسین، نیتروفورانتویین، باسیتراسین، کلرامفنیکل، تتراسیکلین، اریترومایسین و پنی‌سیلین انجام شد. در 101 سویه، حساسیت به نووبیوسین، نیتروفورانتویین و باسیتراسین و مقاومت به سایر آنتی‌بیوتیک‌ها مشاهده شد که احتمالاً به گروه آرکی‌ها تعلق دارند.

شناسایی فیلوژنتیک سویه‌های منتخب: برای تحلیل فیلوژنتیک، از نوبت اول نمونه‌برداری 22 سویه و از نوبت دوم 23 سویه به صورت تصادفی انتخاب شد (جدول 1). نتایج برای 41 سویه به صورت یک طرفه (در جهت رفت) و برای 4 سویه به صورت کامل خوانده شد. جدول 3 نتایج شناسایی مولکولی سویه‌های منتخب و میزان شباهت آنها با نزدیک‌ترین گونه‌های شناخته شده را نشان می‌دهد. از این تعداد، 40 سویه اعضای خانواده Halobacteriaceaبودند. 5 سویه به قلمرو باکتری‌ها متعلق بوده، در جنس‌های Rhodovibrio، Pseudomonas و Salicola (به ترتیب: 40، 40 و 20 درصد سویه‌های باکتریایی) قرار گرفتند.

 

 

جدول 3- نتایج شناسایی مولکولی جدایه‌های منتخب

ردیف

نام جدایه

نزدیکترین سویه

شماره دسترسی نزدیکترین گونه

درصد شباهت

1

A6

Haloferax prahovense TL6(T)

AB258305

100

2

A12A

Haloferaxprahovense TL6(T)

AB258305

99.51

3

AC2

Haloarcula japonica JCM7785(T)

AB355986

98.42

4

AC6

Halobellus clavatus TNN18(T)

GQ282620

94.70

5

AC7

Halogeometricum rufum RO1-4(T)

EU887286

99.45

6

AD1

Halorubrum chaoviator Halo-G(T)

AM048786

99.28

7

AD3

Halorubrum chaoviator Halo-G(T)

AM048786

99.35

8

AD7

Halorubrum chaoviator Halo-G(T)

AM048786

100

9

AM1

Haloarcula argentinensis arg-1(T)

D50849

98.79

10

AM2

Haloarcula japonica JCM7785(T)

AB355986

98.37

11

AM5

Haloarcula japonica JCM7785(T)

AB355986

98.11

12

AM14

Halolamina pelagica TBN21(T)

GU208826

98.26

13

AM17

Haloarcula marismortui ATCC43049(T)

AY596297

97.77

14

AO2

Haloferax alexandrines TM(T)

AB037474

99.84

15

AO7

Halobellus clavatus TNN18(T)

GQ282620

93.98

16

B1A

Haloarcula quadrata 801030/1(T)

AB010964

98.87

17

B2

Haloarcula hispanica ATCC33960(T)

CP002921

99.57

18

B4

Halorubrum chaoviator Halo-G(T)

AM048786

99.29

19

B5

Psuedomonas halophila DSM3050(T)

AB021383

99.88

20

B8

Halorhabdus tiamatea SARL4B(T)

EF127229

100

21

B16

Halorubrum chaoviator Halo-G(T)

AM048786

98.62

22

CW8

Halorubrum chaoviator Halo-G(T)

AM048786

100

23

Ct1

Halorubrum chaoviator Halo-G(T)

AM048786

100

24

Ct4

Halorubrum chaoviator Halo-G(T)

AM048786

99.88

25

D19

Halorubrum chaoviator Halo-G(T)

AM048786

99.27

26

DA5

Haloferax prahovense TL6(T)

AB258308

100

27

DA7

Haloarcula japonica JCM7785(T)

AB355986

97.75

28

DB3

Halobellus clavatus TNN18(T)

GQ282620

93.65

29

DM1

Halobellus clavatus TNN18(T)

GQ282620

93.88

30

DS16

Haloarcula amylolytica BD-3(T)

DQ826513

98.70

31

DW4

Halogeometricum rufum RO1-4(T)

EU887286

99.55

32

E4B

Halobacterium salinarum NRC-1

AE004437

99.61

33

F4

Rhodovibrio sodomensis DSM9895(T)

FR733704

98.99

34

H7

Haloferax prahovense TL6(T)

AB258305

100

35

I1

Haloarcula quadrata 801030/1(T)

AB010964

99.34

36

I3

Haloarcula argentinensis arg-1(T)

D50849

98.60

37

I5

Psuedomonas halophila DSM3050(T)

AB021383

98.57

38

I6A

Haloarcula salaria HST01-2R(T)

FJ429317

98.50

39

I8

Rhodovibrio sodomensis DSM 9895(T)

FR733704

99.10

40

J2

Halorubrum lipolyticum 9-3(T)

DQ355814

96.57

41

J7

Halostagnicola larsenii XH-48(T)

AM117571

98.42

42

O5

Haloferax prahovense TL6(T)

AB258305

99.31

43

O6B

Salicola salis B2(T)

DQ129689

99.65

44

R8

Halorubrum chaoviator Halo-G(T)

AM048786

98.57

45

S1A1

Haloferax prahovense TL6(T)

AB258305

99.54

 

 

درصد فراوانی سویه‌های متعلق به جنس‌های آرکی در شکل 3 نشان داده شده است که بیشترین فراوانی به جنس‌های Haloarcula، Halorubrum و Haloferax متعلق است. جدول 4 جنس‌های آرکی جداسازی شده و تعداد سویه‌های مربوط به هر جنس را در دو نوبت نمونه‌برداری نشان می‌دهد.

 

شکل 3- درصد فراوانی جدایه‌های متعلق به هر جنس

جدول 4- جنس‌های آرکی جداسازی شده و تعداد جدایه‌های مربوط به هر جنس در دو نوبت نمونه‌برداری

ردیف

نام جنس

تعداد جدایه

در نوبت اول

تعداد جدایه

در نوبت دوم

1

Haloarcula

5

7

2

Halorubrum

5

6

3

Haloferax

4

3

4

Halobellus

0

4

5

Halogeometricum

0

2

6

Halobacterium

1

0

7

Halolamina

0

1

8

Halorhabdus

1

0

9

Halostagnicola

1

0

 


 

 

پس از هم راستا کردن سویه‌های ترادف‌یابی شده با ترادف گونه‌های نزدیک درخت‌های فیلوژنتیکی سویه‌های باکتری و آرکی به صورت جداگانه با استفاده از الگوریتم‌های Maximum Likelihood و Neighbor-joining رسم شد که در هر دو روش جایگاه فیلوژنتیکی سویه‌ها در درخت‌های رسم شده با شباهت‌های 16S rRNA سویه‌ها مطابقت داشت. دندوگرام‌های ترسیم شده برای دو قلمرو آرکی‌ها و باکتری‌ها به ترتیب در شکل‌های 4 و 5 نشان داده شده است.

 

 

 

شکل 4- درخت فیلوژنتیک جدایه‌های منتخب متعلق به قلمرو آرکی‌ها رسم شده به روش Neighbour-joining

 

شکل 5- درخت فیلوژنتیک باکتری‌های ترادف‌یابی شده با روش Neighbour-joining. Acetobacter cibinongensis JN004206.1 به عنوان Outgroup در نظر گرفته شده است و اعداد ذکر شده در بخش انشعاب، نشانگر درصد نمونه‌گیری بوت‌استرپ از 100 نمونه است.

 


بحث

به دلیل اهمیت و کاربرد وسیع آرکی‌ها، تحقیقات وسیعی برای بررسی تنوع و شناسایی این گروه از میکروارگانیسم‌ها در سراسر جهان در حال انجام است. مطالعات انجام شده در زمینه شناسایی این گروه در ایران بسیار اندک است و اهمیت بررسی‌های بیشتر در مورد این گروه بسیار محسوس است. دریاچه‌ها و تالاب‌های پُر شور در ایران به عنوان نمونه‌ای از زیستگاه‌های آرکی‌ها از تنوع بالایی برخوردار هستند.

در پژوهش حاضر، برای نخستین بار بررسی تنوع آرکی‌های نمک‌دوست قابل کشت در تالاب اینچه‌برون، به عنوان محیطی منحصر به فرد با هدف بررسی گوناگونی و شناسایی آرکی‌های نمک‌دوست ساکن و تعیین نقشه زیستی این محل انجام شد. pH پایین این تالاب، آن را از سایر اکوسیستم‌های شور بررسی شده در ایران مانند: دریاچه‌ آران و بیدگل و حوض سلطان با شوری بالا و pH خنثی و تالاب گمیشان با شوری پایین و pH قلیایی متمایز می‌کند. میزان یون Mg2+ در این دریاچه نسبت به دریاچه Tuz در ترکیه (Birbir et al., 2007) و دریاچه Maras در پرو (Maturrano et al., 2006) پایین‌تر، اما میزان شوری آن مشابه با دریاچه نمک Maras است. در مقایسه با دریاچه‌های بررسی شده در ایران، میزان یون Mg2+ در دریاچه ارومیه 5/3 برابر و دریاچه آران و بیدگل 5/1 برابر بیشتر از تالاب اینچه‌برون است. میزان شوری آن از دریاچه آران و بیدگل که شوری اشباع دارد پایین‌تر بوده، اما در نوبت دوم نمونه‌برداری، از مناطق سواحل غربی دریاچه ارومیه بالاتر بوده است. شوری هر کدام از مناطق در نوبت دوم نمونه‌برداری نسبت به نوبت اول بیش از 5/1 برابر افزایش داشت که تقریبا! 10 برابر شوری آب دریا است و این مسأله شرایط را برای جداسازی باکتری‌ها که معمولاً نمک‌دوست نسبی هستند، در نوبت اول مناسب‌تر ساخت. در منطقه 4 بالاترین میزان یون آهن وجود داشت و کمترین جداسازی از این منطقه انجام شد. با توجه به این که پس از منطقه 2 این منطقه بالاترین میزان یون سولفات را دارد، می‌توان رنگ سیاه موجود در بخش‌هایی از این منطقه را به احیای سولفات و تشکیل رسوب با آهن به دلیل نزدیکی این مناطق به ویژه منطقه 4 به معدن یُد نسبت داد. لذا، این منطقه برای جداسازی باکتری‌های احیا کننده سولفات مناسب‌تر است. در این پژوهش، به منظور افزایش احتمال جداسازی میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست اجباری، از محیط‌های کشت متنوعی استفاده شد. شکل 6 کارآیی محیط‌های کشت استفاده شده برای جداسازی میکروارگانیسم‌ها را نشان می‌دهد.

 

شکل 6- کارآیی محیط‌های کشت استفاده شده در جداسازی میکروارگانیسم‌ها

در مجموع، محیط‌های MGM و JCM 168 از نظر جداسازی آرکی‌ها و باکتری‌های نمک‌دوست اجباری محیط‌های مناسبی بودند، اما از نظر تنوع، اغلب باکتری‌های جداسازی شده، باکتری‌هایی با کلونی‌های باسیلوسی و اسپوردار بودند و بیشتر آنها در محیط‌های حاوی 5 درصد نمک تام نسبت به محیط‌های حاوی 23 درصد نمک تام رشد مناسب‌تری داشتند.

استفاده از محیط‌هایی نظیر MH1 و JCM در پژوهش‌های مشابه به جداسازی میکروارگانیسم‌های اسید دوست یا قادر به رشد بهینه در pH اسیدی منجر شد (Minegishi et al.,2008; 2009).

به دلیل اسیدی بودن مناطقی از تالاب بررسی شده، در این پژوهش نیز از این دو محیط مناسب، برای جداسازی احتمالی میکروارگانیسم‌های اسید دوست استفاده شد. سویه‌های به دست آمده از محیط JCM برای بررسی توانایی رشد در pH خنثی در محیط MGM با 2/7=pH نیز کشت داده شدند، اما تمام این سویه‌ها قادر به رشد در pH خنثی بودند، بنابراین اسید دوست واقعی در نظر گرفته نمی‌شوند.

استفاده از روش‌های رقیق‌‌سازی متوالی همراه با گرماگذاری طولانی مدت، سبب جداسازی بیشترین تعداد میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست شد. کلونی‌های به دست آمده اغلب دارای رنگیزه‌های قرمز و یا نارنجی بودند. با این وجود، کلونی‌های سفید یا بی‌رنگ و حتی صورتی نیز در برخی از محیط‌ها مشاهده شد. متوسط تعداد کلونی‌های میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست اجباری به دست آمده در روش کشت cfu/ml، 106×1/2 بود. تنوع آرکی‌های نمک‌دوست توصیف شده در پژوهش حاضر، بدون شک تنها بخش اندکی از تنوع حقیقی تالاب اینچه‌برون را نشان می‌دهد. در آب‌های شور به ویژه شورابه‌های قرمز رنگ (red brines) انتظار 107-108 کلونی آرکی وجود دارد که تعداد کلونی‌های بازیابی شده در این پژوهش پایین‌تر است و علت آن احتمالاً پایین بودن میزان شوری این تالاب در مقایسه با سایر تالاب‌ها و دریاچه‌های پُر شور است. همچنین، محیط‌های دارای نمک و مواد غذایی فراوان که در این پژوهش برای شمارش و جداسازی کلونی‌ها استفاده شد بسیار انتخابی عمل می‌کنند. بازیابی قوی‌تر تاکسون‌های موجود با استفاده از محیط‌های دارای مواد غذایی کم و گرماگذاری طولانی‌تر امکان‌پذیر است (Burns et al., 2004).

در قلمرو آرکی‌ها بیشتر جدایه‌ها به اعضای جنس‌های Haloarculaو Halorubrum (به ترتیب با 30 و 5/27 درصد سویه‌ها) مربوط بود. نتایج پژوهش‌های انجام شده در سایر مناطق پُر شور دنیا از این قرار است: Halorubrum و Haloarcula گروه‌های اصلی جدا شده از دریاچه نمک Tuz در ترکیه بوده‌اند (Birbir et al., 2007)؛ اعضای جنس Haloarcula،50 درصد جدایه‌های به دست آمده از دریاچه Maras در پرو را تشکیل داده‌اند (Maturrano et al., 2006)؛ در حوضچه‌های نمکی استرالیا بیش از 70 درصد جدایه‌ها به جنس Halorubrum متعلق بوده است (Burns et al., 2004). همچنین، بررسی‌های انجام شده در دریاچه Ayakekumu در چین 47 درصد توالی‌ها به جنس Halorubrum و 24 درصد توالی‌ها به جنس Natrinema متعلق بوده است (Kuwei et al., 2007).

بر خلاف تالاب اینچه‌برون، در دریاچه‌های آران و بیدگل و ارومیه بیشتر جدایه‌ها به ترتیب اعضای جنس‌های HalorubrumوHaloarculaبوده‌اند و در جنس‌های آرکی به دست آمده از تالاب اینچه‌برون با این مناطق تفاوت‌هایی دیده می‌شود. از این تفاوت‌ها می‌توان به عدم جداسازی اعضایی از جنس Haloferaxاز دریاچه‌های ارومیه و آران و بیدگل اشاره نمود Asadi, 2011)؛ Makhdoumi-kakhki et al., 2012).

در این پژوهش، 7 سویه متعلق به جنس Haloferax (5/17 درصد سویه‌ها) جداسازی شد که بررسی‌ها نشان داد که اعضای این جنس پایین‌ترین میزان بهینه نمک را در میان آرکی‌های نمک‌دوست دارند و به کمترین میزان NaCl برای حفظ ساختار سلولی خود نیازمندند (DSouza et al., 1997). با وجود پایین بودن میزان یون‌های سدیم و منیزیم در منطقه 1، برخلاف انتظار بیشترین تعداد جداسازی میکروارگانیسم‌ها از این منطقه انجام شد، با توجه به این که از تعداد 7 جدایه متعلق به جنس Haloferax، 6 جدایه از این منطقه جداسازی شده است، می‌توان تعداد بالا و غیر قابل انتظار جداسازی از این منطقه را توجیه نمود.

بر اساس نظر Bardavid و همکاران (2008)، تلقیح آب نمک دریاچه بر روی پلیت حاوی غلظت بالای نمک و غنی از مواد غذایی پیچیده موجب جداسازی سویه‌های متعلق به جنس‌های Halorubrum، Haloarcula وHaloferax می‌شود. این مسأله بیشتر به دلیل توانایی رشد آنها در این شرایط است تا اینکه به واسطه فراوانی آنها در محیط باشد (Bardavid et al., 2008). همچنین، با توجه به pH پایین تالاب اینچه‌برون نسبت به دریاچه‌های آران و بیدگل و ارومیه، عدم جداسازی اعضایی از جنس‌های Natronomonasو Natronococcusکه آرکی‌های نمک‌دوست و قلیادوست هستند دور از انتظار نیست.

جنس Halobacterium به عنوان گروه چیره در جمعیت های آرکیایی دریاچه‌های نمک شناخته نشده است (Oren, 2006). در میان جدایه‌های متعلق به اعضای Halobacteriaceae در این پژوهش تنها یک جدایه متعلق به جنس Halobacterium با نام E4B با شباهت توالی 6/99 درصد جداسازی شد. درصد نمک و ترکیبات آلی فراوان موجود در محیط جداسازی می‌تواند یک عامل انتخابی برای جداسازی اعضای این جنس باشد (Birbir et al., 2007).

در مجموع، میزان شباهت توالی 16S rRNA برای 12 سویه بین 97-7/98 درصد بود که با انجام هیبریداسیون DNA-DNA با گونه‌های نزدیک و بررسی صفات فنوتیپی ممکن است در گونه جدیدی قرار گیرند. برای 5 سویه درصد شباهت کمتر از 97 درصد با اعضای جنس‌های Halobellus و Halorubrum نشان داده شده که بیانگر تفاوت شایان توجه در سطح گونه و یا حتی جنس بین این سویه‌ها و گونه‌های ثبت شده بود، این سویه‌ها می‌توانند بدون انجام هیبریداسیون DNA-DNA با گونه‌های نزدیک در گونه‌های جدید قرار گیرند (Stackebrandt, 2006). در 7 سویه درصد شباهت 100 درصد بود و به عنوان سویه‌های بومی گونه‌های مشابه خود در نظر گرفته می‌شوند. در جدول 5، سویه‌هایی که می‌توانند معرف جنس‌ها و گونه‌های جدید باشند نشان داده شده است.

 

 

جدول 5- سویه‌هایی که می‌توانند معرف جنس‌ها و گونه‌های جدید باشند

نام سویه

شباهت ترادف 16S rRNA

AC6, AO7, DB3, DM1, J2.

93-97 درصد

AC2, AM1,AM5, AM14, AM17,B16, DA7, DS16, I3, I5, I6A, R8.

97-9/98 درصد

 

 

با توجه به تأکید این پژوهش بر جداسازی میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست اجباری، محیط‌های کشت مناسب برای جداسازی نمک‌دوست های نسبی و تحمل کننده نمک انتخاب نشده بود، در نتیجه امکان جداسازی مناسب اعضا این گروه وجود نداشت. با وجود این، در قلمرو باکتری‌ها بیشترین گروه‌های جداسازی شده اعضای جنس Rhodovibrio بود که باکتری‌های نمک‌دوست نسبی هستند و نخستین بار از رسوبات و آب‌های دریای مرده جداسازی شده‌اند و به proteobacteriaα متعلق هستند. اعضای جنس‌های Salicola و Pseudomonas از دیگر جنس‌های جداسازی شده از قلمرو باکتری‌ها در این پژوهش بود. Salicola باکتری بدون رنگدانه و نمک‌دوست اجباری است که نخستین بار از دریاچه‌های نمک کم عمق در الجزایر جداسازی شده است (Kharroub et al., 2006). Pseudomonas halophila نیز باکتری نمک‌دوست نسبی است و نخستین بار از دریاچه Great salt lake در آمریکا جداسازی شد (Fendrich, 1988).

در مجموع، جداسازی و شناسایی میکروارگانیسم‌ها به عنوان گنجینه‌ای از ذخایر زیستی کشور از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است و دانش تنوع زیستی ابزار قدرتمندی برای رسیدن به این مهم فراهم می‌کند. در این پژوهش برای نخستین بار بررسی تنوع آرکی‌های نمک‌دوست اجباری از تالاب اینچه‌برون انجام شد که با توجه به تعداد محدود جنس‌های آرکی نمک‌دوست شناسایی شده، بررسی‌ها بیانگر تنوع نسبتاً بالای آرکی‌های نمک‌دوست در این تالاب است.

Amoozegar, M. A., Ghasemi, A., Razavi, M. R. and Naddaf, S. (2007) Evaluation of hexavalent chromium reduction by chromate-resistant moderately halophile, Nesterenkonia sp. Strain MF2. Process Biochemistry 42: 1475-1479.

Amoozegar, M. A., Malekzadeh, F. and Malik, K. A. (2003) Production of amylase by newly isolated moderate halophile, Halobacillus sp. Strain MA-2. Journal of Microbiological Methods 52: 353-359.

Asadi, B. (2011) Diversity of aerobic extremely halophilic prokaryotes from western coastal line of Urmiah lake using culture-dependent and culture-independent methods. MSc thesis, University of Tehran, Tehran, Iran (in Persian).

Bardavid, R. E., Khristo, P. and Oren, A. (2008) Interrelationships between Dunaliella and halophilic prokaryotes in saltern crystallizer ponds. Extremophiles 12: 5-14.

Birbir, M., Calli, B., Mertoglu, B., Bardavid, E. R., Oren, A., Mehmet, N.O. and Ogan, A. (2007) Exremely halophilc archaea from Tuz Lake, Turkey and the adjacent Kaldirim and Kayacil salterns.World Journal ofMicrobiology and Biotechnology 23: 309-316.

Burns, D. G., Camakaris, H. M., Janssen, P. H. and Dyall-Smith, M. L. (2004) Combined use of cultivation-dependent and cultivation-independent methods indicates that members of most haloarchaeal groups in an Australian crystallizer pond are cultivable. Applied and Environmental Microbiology 70: 5258-5265.

DSouza, S. E., Altekar, W., DSouza, S. F. (1997) Adaptive response of Haloferax mediterranei to low concentration of NaCl (<20%) in the growth medium. Archives of Microbiology168: 682-689.

Dussault, H. (1955) An improved technique for staining red halophilic bacteria. Journal of Bacteriology 70: 484-485.

Dyall-Smith, M. L. (2008) The halohandbook: protocols for haloarchaeal genetics. Retrieved from http://www.haloarchaea.com/resources/halohandbook. On 2 April 2009.

Felsenstein, J. (1985) Confidence limits on phylogenies: an approach using bootstrap. Evolution 39: 783-791.

Fendrich, C. (1988) Halovibrio variabilis gen. nov. sp. nov., Pseudomonas halophila sp. nov. and a new halophilic aerobic coccoid Eubacterium from Great Salt Lake, Utah, USA. Systematic and Applied Microbiology 11: 36-43.

Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Wood, W. A. and Krieg, N. R. (1994) Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology, Washington, DC.

Jiang, H., Dong, H., Zhang, G., Yu, B., Chapman, L. R. and Fields, M. (2006) Microbial diversity in sediments of lake Chaka, an athalassohaline lake in northwestern China. Applied and Environmental Microbiology 72(6): 3832-3845.

Kharroub, K., Aguilera, M., Quesada, T., Morillo, J. A., Ramos-Cormenzana, A., Boulharouf, A. and Monteoliva-Sánchez, M. (2006) Salicola salis sp. nov., an extremely halophilic bacterium isolated from Ezzemoul sabkha in Algeria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 56: 2647-2652.

Kolmodin, L. A. and Williams, J. F. (1994) PCR cloning protocols. In: Methods in molecular biology. (ed. White, B. A.) 192: 3-15. Humana press, New Jersey.

Kumar, S., Nei, M., Dudley, J. and Tamura, K. (2008) MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings in Bioinformatics 9(4): 299-306.

Kuwei, K., Min, W., Yuehong, W. and Huibin, Zh. (2007) Culturable halophic archaeal diversity of Ayakekumu salt lake located in Xinjiang, China. Acta Ecologica Sinicia 27(8): 3119-3123.

Ma, Y., Galinski, E. A., Grant, W. D., Oren, A. and Ventosa, A. (2010) Halophiles 2010: Life in saline environmen. Applied and Environmental Microbiology 76(21): 6971-6981.

Makhdoumi-Kakhki, A., Amoozegar, M. A., Kazemi, B., Pasic, L. and Ventosa, A. (2012) Prokaryotic diversity in Aran-Bidgol Salt Lake, the largest hypersaline playa in Iran. Microbes and Environments 27(1): 87-93.

Marmur, J. (1961) A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. Journal of Molecular Biology 3: 208-218.

Maturrano, L., Santos, F., Rossello-Mora, R. and Anton, J. (2006) Microbial diversity in Maras salterns, a hypersaline environment in the Peruvian Andes. Applied and Environmental Microbiology 72: 3887-3895.

Minegishi, H., Echigo, A., Nagaokam S. h., Kamekura, M. and Usami, R. (2009) Haloarchaeum acidophilum gen. nov., sp. nov., a moderately acidophilic haloarchaeon isolated from commercial solar salt. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.

Minegishi, H., Mizuki, T., Echigo, A., Tadamasa, F., Kamekura, M. and Usami, R. (2008) Acidophilic haloarchaeal strains are isolated from varios solar salts. Saline Systems 4: 16.

Oren, A. (2006) The order Halobacteriales. In: The Prokaryotes (eds. Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. H. and Stachkebrandt, E.) 3: 113-164. Springer, New York.

Rohban, R., Amoozegar, M. A. and Ventosa, A. (2009) Screening and isolation of halophilic bacteria producing extracellular hydrolyses from Howz Soltan Lake, Iran. The Journalof Industrial Microbiologyand Biotechnology 36: 333-340.

Saitou, N. and Nei, M. (1987) The neighbor joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4: 406-425.

Stackebrandt, E. and Ebers, J. (2006) Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards. Microbiology Today 33(4): 152-155.