جداسازی و شناسایی باکتری‌های پلی‌اکستریموفیل قلیادوست، نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک تالاب قلیایی شور-دریایی گمیشان

نویسندگان

1 بخش میکروبیولوژی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران و؛ بانک میکروارگانیسم‌ها، مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران، کرج، ایران

2 بخش میکروبیولوژی، دانشکده ‌زیست‌شناسی و قطب تبارزایی موجودات زنده، پردیس علوم، دانشگاه تهران، تهران، ایران و؛ بانک میکروارگانیسم‌ها، مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران، کرج، ایران

3 گروه میکروبیولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تهران شمال، تهران، ایران

چکیده

تالاب گمیشان یک اکوسیستم طبیعی در 35 کیلومتری شمال غربی گرگان، در جوار غربی شهر خواجه نفس و گمیشان واقع است. نمونه‌برداری از سه موقعیت جغرافیایی مختلف، در دو نوبت فصل خشک و بارش، منجر به جداسازی 224 جدایه شد. از بین جدایه‌ها، 57 سویه برای بررسی رفتارهای نمک‌دوستی و تحمل‌کنندگی نمک و همچنین، بهینه و محدوده رشد در اسیدیته و دماهای مختلف بررسی شدند. بیشتر سویه‌های نمک‌دوست نسبی و تحمل‌کننده نمک قادر به رشد بهینه در اسیدیته 5/8-9 بودند و محدوده دمای رشد 0-40 درجه سانتیگراد را نشان دادند. سویه‌ها از نظر تولید آنزیم‌های هیدرولازی مطالعه شدند. فعالیت لیپازی در اغلب جدایه‌ها مشاهده شد و به ترتیب 15، 7 و 3 سه سویه از کل سویه‌ها آمیلاز، پروتئاز و DNase تولید کردند. این آنزیم‌ها در برخی فرآیندهای صنعتی می‌تواند سودمند باشد. بررسی فیلوژنتیک ترادف 16S rDNA برای 55 سویه انجام شد. این سویه‌ها از نظر فیلوژنتیک در 22 جنس مختلف Achromobacter، Aeromicrobium، Altererythrobacter، Bacillus، Caenispirillum، Cyclobacterium، Erythrobacter، Halobacillus، Halomonas، Idiomarina، Jonesia، Marinobacter، Martelella، Nesiotobacter، Paenibacillus، Planococcus، Pseudomonas، Rheinheimera، Saccharospirillum، Stappia، Thalassospira و Vibrio قرار گرفتند. 23 درصد از این سویه‌ها باکتری‌های نمک‌دوست قلیادوست بودند که به جنس‌های Bacillus، Halobacillus، Halomonas، Idiomarina و Marinobacter تعلق داشتند. این بررسی، نخستین مطالعه بر روی باکتری‌های قابل کشت تالاب گمیشان، یک اکوسیستم قلیایی شور-دریایی مهم، است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and identification of poly-extremophilic alkalophilic, halophilic and halotolerant bacteria from alkaline thalassohaline Gomishan wetland

نویسندگان [English]

  • Azadeh Shahinpei 1
  • Mohammad Ali Amoozegar 2
  • Abbas Akhavan-Sepahi 3
1 Department of Microbiology, Faculty of Basic Science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran & Microorganisms Bank, Iranian Biological Resource Centre, Karaj, Iran
2 Department of Microbiology, Faculty of Biology and Center of Excellence in Phylogeny of Living Organisms, College of Sciences, University of Tehran, Tehran, Iran Microorganisms Bank, Iranian Biological Resource Centre, Karaj, Iran
3 Department of Microbiology, Faculty of Biological Sciences, Islamic Azad University, North Tehran Branch, Tehran, Iran
چکیده [English]

Gomishan wetland is a natural ecosystem located in 35 km north west of Gorgan, in the west vicinity of Khajeh Nafas city and Gomishan. Twice sampling from 3 different geographic positions in dry and rainy seasons, led to the isolation of 224 isolates. For 57 isolates, halophilic and halotolerant behaviors and also optimum and growth range in different pH and temperatures were determined. Most of the moderately halophilic and halotolerant strains were capable of growing optimally in media with pH 8.5-9 and optimum growth temperatures ranging from <4 to 40 °C. The isolates were examined for hydrolytic enzymes production. Most of the isolates showed lipase activites and a total of 15, 7 and 3 strains produced amylases, proteases and DNases, respectively. The enzymes could be useful in some industrial processes. 16S rDNA phylogenetic analysis were done for 55 strains. According to this analysis, strains were placed in 22 different genera: Achromobacter, Aeromicrobium, Altererythrobacter, Bacillus, Caenispirillum, Cyclobacterium, Erythrobacter, Halobacillus, Halomonas, Idiomarina, Jonesia, Marinobacter, Martelella, Nesiotobacter, Paenibacillus, Planococcus, Pseudomonas, Rheinheimera, Saccharospirillum, Stappia, Thalassospira and Vibrio. 23% of these strains were haloalkalophilic bacteria and belonged to the Bacillus, Halobacillus, Halomonas, Idiomarina andMarinobacter.This was the first study on the culturable bacteria at Gomishan wetland, an area of considerable alkaline thalassohaline ecosystem.
 

کلیدواژه‌ها [English]

  • Gomishan wetland
  • Halophile
  • Halotolerant
  • 16S rDNA

مقدمه

تالاب بین‌المللی گمیشان نوار نسبتاً باریکی است که با برای شمالی-جنوبی در امتداد سواحل شرقی دریای خزر قرار گرفته است. این تالاب تقریباً از دو کیلومتری شمال شهر گمیشان آغاز شده و تا مرز ترکمنستان و فراسوی آن یعنی تا هشت کیلومتر در خاک ترکمنستان نیز ادامه پیدا می‌کند. مساحت آن بیست هزار هکتار و ارتفاع آن 27 متر پایین‌تر از سطح آب‌های آزاد است. این تالاب به لحاظ هم‌پیوندی با دریای خزر (حاشیه اقلیمی معتدل) در کنار یک اقلیم خشک، ایجاد میکرو‌اقلیم‌هایی می‌کند که تبعات زیستگاهی با ارزشی را به ارمغان آورده است. کلر و سدیم بیشترین یون‌های موجود در تالاب بوده که تأییدی بر تقسیم‌بندی تالاب در گروه دریاچه‌های تالازوهالین است. مقدار نمک دریاچه 3-5 درصد و متوسط اسیدیته آن 8/8 است (بهروزی‌راد، 1386). هدف اصلی در اکولوژی میکروبی درک تنوع میکروبی در زیستگاه‌های طبیعی است. بنابراین، شناخت ما از میکروارگانیسم‌ها و همچنین زیستگاه‌ها ضروری است (Grant, 1992). توزیع و فراوانی نوع خاصی از محیط‌های افراطی برای تعیین رتبه ویژگی زیوگان (biota) بسیار مهم است (Rodriguez-Valera, 1993). مهم‌ترین اکوسیستم‌های پرشور که تاکنون بررسی شده است شامل دریاچه بزرگ شور ایالت یوتا آمریکا، دریای مرده، شورابه‌های به شدت قلیایی وادی ناترون مصر و دریاچه ماگادی (Magadi) کنیا هستند Oren, 1994)؛ Kamekura, 1998)، Oren, 2002a. دریاچه‌های پرشور آران و بیدگل، ارومیه و حوض سلطان در ایران نیز اکوسیستم‌های با اهمیتی هستند که از نظر تنوع میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست بررسی شده‌اند Rohban et al., 2009)؛ Makhdoumi Kakhki et al., 2012). محیط‌های پرشور به علت سختی شرایط، تنوع میکروبی کمتری نسبت به محیط‌های معمولی دارند، اما تنوع فیلوژنتیک میکروارگانیسم‌هایی که در غلظت‌های بالای نمک زندگی می‌کنند، شگفت‌انگیز است. تنوع متابولیسمی نمک‌دوست‌ها نیز به همان اندازه قابل توجه است (Oren, 2002b). آنها مدل‌های ارزشمندی برای بررسی مولکولی سازگاری اسمزی پروکاریوتی هستند که پتانسیل کاربرد در زیست‌فناوری و میکروبیولوژی کاربردی را دارند (Kushner and Kamekura, 1988). به طور طبیعی محیط‌هایی با مقادیر اسیدیته بالا که رشد میکروبی را حمایت می‌کنند در بسیاری از اکوسیستم‌ها پراکنده شده‌اند. اغلب ارگانیسم‌های در حال رشد در این محیط‌ها مقادیر اسیدیته به مراتب بالاتر از خنثی را تجربه می‌کنند. ارگانیسم‌هایی که در محیط‌های بسیار قلیایی زیست می‌کنند، ارائه‌دهنده سازگاری‌های گسترده فرآیندهای زیستی برای غلبه بر شرایط مختلف محیطی هستند (Ulukanli, 2002). هدف از این پژوهش، بررسی تنوع زیستی باکتری‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک ساکن در تالاب قلیایی شور-دریایی گمیشان و نیز امکان دستیابی به جنس، گونه یا سویه جدید از میکروارگانیسم‌های بومی این منطقه است.

 

مواد و روش‌ها

نمونه‌ها از سه موقعیت تالاب (مناطق شمال‌شرقی (C)، جنوب‌شرقی (B) و جنوب‌غربی تالاب (A)) در دو فصل خشک و بارش به ترتیب در شهریور و بهمن ماه سال 1389 جمع‌آوری شد. طول و عرض جغرافیایی دقیق مناطق نمونه‌برداری توسط GPS ثبت و روی تصویر ماهواره‌ای علامت‌گذاری شد (شکل 1). نمونه‌های مختلف جمع‌آوری شده از هر منطقه درون کیسه‌های پلاستیکی و لوله‌های فالکون استریل ریخته شد و دما، اسیدیته و میزان ذرات جامد محلول در آب (Total Disolved Solids) نمونه‌ها به ترتیب با دماسنج، pH‌متر و TDS‌متر قابل حمل در محل اندازه‌گیری و ثبت شد. انتخاب این مناطق بر اساس نقاط قابل نمونه‌برداری تالاب و ویژگی‌های ظاهری هر منطقه بود. نمونه‌ها در دمای محیط و در طی یک روز به آزمایشگاه منتقل و میزان شوری آنها نیز اندازه‌گیری شد. آنالیز شیمیایی آب تالاب برای سنجش عناصر موجود در محیط‌زیست طبیعی باکتری‌های این اکوسیستم و به‌کارگیری آن در طراحی محیط‌کشت مناسب که امکان جداسازی طیف گسترده‌تری از باکتری‌ها را فراهم سازد، توسط شرکت خاک بهین آزما صورت گرفت.

 

 

شکل 1- الف) موقعیت تالاب گمیشان در نقشه ایران، ب) موقعیت سه نقطه نمونه‌برداری (earth.google.com)، ج) جنوب‌غربی (منطقه باتلاقی) د) گیاهان شورپسند غوطه‌ور در آب تالاب

 

 

متعاقباً نگهداری نمونه‌ها در دمای 4 درجه سانتیگراد صورت گرفت. برای جداسازی باکتری‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک از محیط‌کشت مارین آگار (MA, Marine agar) با ترکیبات زیر استفاده شد (g l-1):

.NaCl, 19.45; MgCl2,8.8; Peptone, 5.0; .Na2SO3,3.24; CaCl2,1.8; Yeast extract, 1; .KCl, 0.55; NaHCO3,0.16; Ferric Citrate, 0.1; .KBr, 0.08; H3BO3,0.02; Na2HPO4,8.0 mg; .NaF, 2.4 mg; NH4NO3,1.6 mg; Agar, 15.0; .Distilled water, 1000ml

اسیدیته محیط 5/7 تنظیم شد (Ronald, 2005). برای کشت و جداسازی احتمالی باکتری‌های نمک‌دوست قلیادوست و تحمل‌کننده‌ قلیا از محیط‌کشت MAHA (Modified Alkalophilic Halophile agar) استفاده شد. مقدار نمک این محیط 5 درصد در نظر گرفته شد و اسیدیته آن 5/9 تنظیم شد. برای ایجاد شرایط قلیایی مجموعاً 19 گرم در لیتر از Na2CO3,10.6 و NaHCO3,8.42 استفاده شد (Ronald, 2005) (gl-1):

.NaCl, 30.0; Peptone, 5.0; Yeast extract, 2.0; .Meat extract, 1.0; Tri-Soidum Citrate, 0.12; .KCl, 0.08; MgSO4.7H2O, 0.04; FeSO4.7H2O, .2.0 mg; MnCl2.4H2O, 0.36 mg; Agar, 15.0; .Distilled water, 1000ml

برای بررسی میکروارگانیسم‌ها در سیستم‌های طبیعی- بر حسب تعداد کل، تعداد جوامع خاص یا فعالیت‌های متابولیکی آنها- نمونه‌های شاخص آنالیز شد و نتایج آن به کل جامعه تعمیم داده می‌شوند. نمونه باید نمایان‌گر تنوع و تراکم موجودات در کل محیط نمونه‌برداری باشد. برای مثال نمونه‌های خاک جمع‌آوری شده از مکان A با هم مخلوط شده و به عنوان نمونه شاخص در نظر گرفته شد (Atlas and Bartha, 1998) سپس، از این نمونه‌های شاخص سری رقت متوالی تهیه و در محیط‌های تعریف شده کشت شد. تمام محیط‌های فوق در دماهای 34 درجه سانتیگراد گرماگذاری شد. تمامی کلونی‌های رشد یافته روی محیط‌های جامد پس از 24، 48، 72 ساعت و همچنین، به منظور جداسازی کلونی‌های کند رشد تا شش ماه پس از گرماگذاری روی محیط‌های جامد مشابه، جداسازی و خالص شد. خالص‌سازی سویه‌ها، پس از رشد و ظاهر شدن کلونی، حتی‌المقدور از تک کلونی‌ها کشت خالص به عمل آمد (Caton, 2004). برای تأیید خالص بودن کلونی‌ها رنگ‌آمیزی گرم بر اساس روش Hucker انجام شد (Gerhardt and Murray, 1994). به منظور تسهیل بررسی جدایه‌ها از نمونه‌های مختلف، سویه‌ها خالص شده بر مبنای مکان جدا شده، نوع نمونه و همچنین نوع محیط‌کشت استفاده شده به صورت زیر نام‌گذاری شدند:

A: مکان A، B: مکان B، C: مکان C، G: تالاب گمیشان، P: نمونه گیاهی، F: رسوبات، S: خاک،
W: آب، X: (Marine agar): محیط مارین آگار؟،
Y: (Modified Alkalophilic Halophile agar): محیط تغییر یافته هالوفیل آلکالوفیل آگار.

بررسی خصوصیات فنوتیپی و بیوشیمیایی تمامی سویه‌ها با استفاده از روش Simbert و Krieg (1994) انجام شد.

برای افتراق باکتری‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک از محیطی با ترکیب زیر استفاده شد (g l-1):

.Yeast extract, 5; SW medium: NaCl, 234; .MgCl2.6H2O, 39; CaCl2, 1; MgSO4.7H2O, 61; .KCl, 6; NaHCO3, 0.2; KBr, 0.7

محیط SW با غلظت نمکی 30 درصد تهیه شد و به نسبت‌های متفاوت برای درصدهای نمکی 0 تا 25 به محیط پایه اضافه شد. اسیدیته محیط 5/8 تنظیم شد. در شیکر انکوباتور با دمای 34 درجه سانتیگراد و 150 دور در دقیقه گرماگذاری شدند. سویه‌هایی که علاوه بر توانایی رشد در محیط فاقد نمک دارای رشد بهینه در کمتر از 3 درصد نمک (معادل غلظت نمک دریا) بودند، به عنوان سویه‌های تحمل‌کننده نمک و آن دسته که بهینه رشد در بالای 3 درصد نمک داشتند و قادر به رشد در محیط فاقد نمک نبودند به عنوان نمک‌دوست در نظر گرفته شدند و محدوده رشد نمک در این باکتری‌ها تعیین گردید.

برای بررسی محدوده اسیدیته رشد و نیز میزان بهینه آن از محیط‌های مایع با ترکیب زیر استفاده شد (g l-1):

.Nutrient broth, 8; NaCl, 30; HEPES, 50mM; .CAPS, mM

از بافر HEPES در دامنه اسیدیته 4 تا 9 و برای اسیدیته بالاتر 10 و 11 از بافر CAPS در محیط‌ها استفاده شد. اسیدیته محیط‌ها پیش از اتوکلاو در بازه بین 4 تا 11 با فاصله‌های 1 و نیم واحدی تنظیم شد و پس از اتوکلاو نیز تأیید شد.

برای بررسی محدوده دمای رشد از محیط‌کشت نوترینت آگار برای دما‌های 5 تا10 درجه سانتیگراد و نوترینت براث برای دما‌های بین 10 تا 50 درجه سانتیگراد استفاده شد و میزان اسیدیته بر روی 5/8 تنظیم شد. برای هر یک از سویه‌های انتخاب شده میزان مورد نیاز از نمک NaCl نیز اضافه شد.

فعالیت آنزیم‌های هیدرولازی: این بررسی تنها روی سویه‌های منتخب برای مطالعه فیلوژنتیک صورت گرفت. در این مرحله سنجش به روش پلیت انجام گردید. محیط‌ها همگی دارای 3 درصد NaCl بودند و اسیدیته آنها 5/8 تنظیم شد (Rohban et al., 2009).

تولید خارج سلولی آمیلاز: برای بررسی تولید آنزیم آمیلاز از محیط‌کشت با ترکیب زیر استفاده شد (g l-1):

.Soluble starch, 10; Beef extract, 3; Agar, 15

پس از رشد در محیط، لوگل (یدید پتاسیم)، بر روی محل رشد باکتری اضافه شد. ایجاد هاله شفاف نشانه تولید آنزیم خارج سلولی آمیلاز و هیدرولیز نشاسته در برون سلول است (Amoozegar et al., 2003).

تولید خارج سلولی پروتئاز: برای بررسی تولید آنزیم پروتئاز، از یک محیط‌کشت با ترکیب زیر استفاده شد (g l-1):

.Meat extract, 3; Peptone, 5; Skim milk, 20; .Agar, 15

وجود هاله شفاف در اطراف کلونی‌ها پس از دو هفته گرماگذاری نشانه هیدرولیز پروتئین کازئین بوده، به عنوان پاسخ مثبت در نظر گرفته شد (Amoozegar et al., 2008).

تولید خارج سلولی لیپاز: برای بررسی هیدرولیز توئین 80 از محیط‌کشت زیراستفاده شد (g l-1):

.Peptone, 10; Tween80, 10; CaCl2.H2O, 0.1; .Agar, 15

ایجاد نواحی رسوب اطراف کلونی‌ها به صورت دانه‌های سفید همراه با هاله کدر، نشان‌دهنده تولید آنزیم لیپاز توسط باکتری است. به تناسب ضعف و قوت آنزیم لیپاز گستردگی محوطه رسوب کمتر یا بیشتر شد (Martin et al., 2003).

تولید خارج سلولی داکسی ریبونوکلئاز: برای بررسی فعالیت داکسی‌ریبو‌نوکلئازی سویه‌ها از محیط داکسی‌ریبو‌نوکلئاز تست-آگار به میزان 40 گرم در لیتر استفاده شد. برای تشخیص بهتر، مقدار 0008/0 گرم در لیتر تولوئیدن بلو به محیط فوق اضافه شد. پس از رشد از کلریدریک اسید یک نرمال به عنوان معرف استفاده شد. مشاهده هاله روشن‌تر در اطراف رشد به عنوان پاسخ مثبت گزارش شد.

تکثیر 16S rRNA توسط واکنش زنجیره‌ای پلیمراز: برای استخراج DNA باکتری‌ها از روش دست‌ورزی شده استخراج DNA پیشنهاد شده توسط Marmur در سال 1994 استفاده شد.

برای تکثیر ژن 16S rRNA از پرایمرهای عمومی 27F.(5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG)
و 1492R (5'- GGT TAC CTT GTT ACG ACT)
استفاده شد (Spencer, et al., 2004). غلظت مواد به کار رفته در تهیه مخلوط واکنش زنجیره پلیمراز برای حجم واکنش 50 میکرولیتر به این صورت است:

.PCR buffer (10X), 50μl; MgCl2 (5 mM), .1.5ml; dNTP mix (10 mM), 1 ml; Primers (10 .mM each), 1.25ml; Taq DNA polymerase, 0.25 .ml; Template DNA, 2-3ml; Sterilized distilled .water, 38-39ml

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با این روش صورت گرفت: دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. چرخه تکثیر شامل 30 سیکل تکرار شونده با دمای دناتوراسیون 94 درجه سانتیگراد به مدت 60 ثانیه، دمای اتصال 55 تا 60 درجه سانتیگراد (دمای اتصال پرایمرها برحسب سویه‌های مختلف متفاوت بود، لذا، برای بهینه‌سازی دمای اتصال هر سویه از روش گرادیان استفاده شد) به مدت 45 ثانیه و دمای سنتز 72 درجه سانتیگراد به مدت 45-50 ثانیه بود. پس از اتمام چرخه‌ها و به منظور تکمیل نهایی ساختار DNA تکثیر شده، نمونه‌ها به مدت 7 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد نگهداری شد.

5 میکرولیتر از محصول PCR به همراه شاهد مثبت و منفی PCR و شاخص وزن مولکولی با طیف 100-10000 bp روی ژل آگاروز 5/0 تحلیل شد و برای ترادف‌خوانی به شرکت ماکروژن در کره جنوبی فرستاده شد. ترادف‌های به دست آمده با نرم‌افزار Chromas Pro مرتب شده، با نرم‌افزار BLAST با توالی‌های ثبت شده موجود در پایگاه اطلاعات ژنومی GenBank و Eztaxon مقایسه شد. به این ترتیب، نزدیک‌ترین سویه‌ها با ترادف 16S rRNA مشابه با سویه‌های منتخب PCR شده تعیین شد. تحلیل فیلوژنتیک باکتری‌های منتخب با سویه‌های نزدیک به آنها با نرم‌افزار ClustalX (نسخه 0/2) انجام شد. بررسی ارتباط فیلوژنتیکی توالی‌های به دست آمده با یکدیگر و دیگر سویه‌ها توالی‌های مرتبط به دست آمده حاصل از جستجو در پایگاه‌های اطلاعاتی Genbank و Eztaxon با نرم‌افزار MEGA (نسخه 0/5) درخت فیلوژنتیک با الگوریتم‌های Maximum likelihood، Neighbour-joining و Maximum parsimony نیز رسم گردید .(Tamura and Dudley, 2007) بررسی اعتبار شاخه‌های درخت با الگوریتم bootstrap analysis و با 1000 بار نمونه‌گیری صورت گرفت. توالی‌های به دست آمده در این پژوهش در بانک ژنی NCBI ثبت و شماره ژنی مربوط به هر توالی دریافت گردید.

 

نتایج

بررسی‌های فیزیکوشیمیایی: اطلاعات مربوط به مشخصات فیزیکوشیمیایی نمونه‌ها در جدول 1 آورده شده است. در نمونه‌گیری شهریور ماه بیشترین دما مربوط به منطقه C یعنی 35 درجه سانتیگراد است، شوری آب این منطقه حدود 36 گرم بر لیتر برآورد شد، که نسبت به دو منطقه دیگر بالاتر بود. با توجه به بستر جلبکی این تالاب، اسیدیته قلیایی آن قابل توجیه است. این بستر در منطقه جنوب‌شرقی وسعت بالاتری دارد و به همان نسبت اسیدیته این منطقه نسبت به دو منطقه دیگر بالاتر است. در نمونه‌های خاک نیز میزان شوری و TDS در هر سه مکان نمونه‌گیری در فصل خشک نسبت به فصل بارش بیشتر گزارش شد. جدول 1 نتیجه سنجش غلظت برخی از آنیون‌ها و کاتیون‌های مهم موجود در ساختار نمک تالاب را نشان می‌دهد.

 

 

جدول 1- مشخصات فیزیکوشیمیایی نمونه‌های آب و خاک در دو نوبت نمونه‌گیری و غلظت برخی از یون‌های مهم نمونه آب از تالاب گمیشان

فصل خشک

فصل بارش

نمونه آب

اسیدیته

دما (˚C)

TDS
(g l-1)

شوری
(g l-1)

اسیدیته

دما (˚C)

TDS
(g l-1)

شوری
(g l-1)

منطقه جنوب‌غربی (A)

84/8

3/27

5/23

25/26

6/7

8

07/8

42/9

منطقه جنوب‌شرقی (B)

42/9

4/33

3/21

16/27

44/8

3/9

26/4

80/4

منطقه شمال‌شرقی (C)

60/7

3/35

7/26

95/35

16/8

1/8

47/15

8/19

نمونه خاک

TDS (g l-1).
بر حسب محلول 100 (m)
مولال خاک

شوری (g l-1)

TDS (g l-1).
بر حسب محلول 100 (m) مولال خاک

شوری (g l-1)

منطقه جنوب‌غربی (A)

04/7

14/8

mg/l857

83/0

منطقه جنوب‌شرقی (B)

24/2

38/2

04/2

14/2

منطقه شمال‌شرقی (C)

16/9

82/10

mg/l1531

57/1

غلظت برخی یون‌ها
در نمونه آب (ppm)

1/0

Mn

91/196

K

28/1921

Mg

67/14467

Cl

025/0

Ni

85/14

Zn

45/729

Ca

15/9730

Na

01/0

Cu

01/5

Fe

54/274

HCO3

5107

SO4

 


تنوع میکروارگانیسم‌های جداسازی شده از تالاب گمیشان: از نمونه‌های مختلف جمع‌آوری شامل شورابه‌ها، خاک، رسوبات و گیاهان در مجموع، 224 باکتری جدا شد. از این تعداد، 164 سویه مربوط به نمونه‌گیری در فصل خشک و 60 سویه در رابطه با نمونه‌گیری در فصل بارش است. متوسط میزان کلونی‌های به دست آمده در روش کشت (شمارش زنده) در دو نوبت نمونه‌گیری در هر منطقه در نمونه‌های آب و خاک محاسبه شد و نتایج آن در جدول 2 آمده است. بیشترین تعداد جدایه از محیط MA دارای اسیدیته 5/7 بود. شایان ذکر است که حدود 5/29 درصد کل جدایه‌ها معادل با 66 سویه از محیط قلیایی جدا شد.

در میان مناطق نمونه‌برداری، منطقه A با 97 و منطقه B با 69 جدایه، بیشترین و منطقه C با 58 کمترین تعداد جدایه را داشت. در شکل 2 رابطه بین مناطق مختلف نمونه‌برداری و نوع جدایه‌ها بر مبنای رنگ‌آمیزی گرم نشان داده شده است. تفکیک کل جدایه‌ها بر اساس رنگ‌آمیزی گرم نشان داد که باسیل‌های گرم‌مثبت غیر‌رشته‌ای با تعداد 131 جدایه و پس از آن باسیل‌های گرم‌منفی با 54 جدایه بیشترین تعداد و اشکال خمیده گرم‌منفی با 32 جدایه و کوکوس‌های گرم‌مثبت با 7 جدایه با فراوانی بسیار کمتری جداسازی شد.

 

جدول 2- شمارش زنده در دو نوبت نمونه‌برداری از آب و خاک

مناطق نمونه‌برداری

فصل بارش

متوسط میزان کلونی‌های به دست آمده
CFU/ml

آب

خاک

منطقه جنوب‌غربی (A)

103×5/2

106×2/7-5/2

منطقه جنوب‌شرقی (B)

103×9/2

106×2/7-2/2

منطقه شمال‌شرقی (C)

104×9/2

106×2/3-9/1

 

فصل خشک

 

متوسط میزان کلونی‌های به دست آمده
CFU/ml

 

آب

خاک

منطقه جنوب‌غربی (A)

103×8/8-2/1

107×2/3-4/1

منطقه جنوب‌شرقی (B)

104×3/2

106×8/6-5/1

منطقه شمال‌شرقی (C)

104×8/4-2/2

106×6-5/1

 

 

شکل 2- فراوانی باکتری‌های جدا شده از سه نقطه نمونه‌برداری و نوع جدایه‌های هر منطقه بر اساس رنگ‌آمیزی گرم

 

 

باسیل‌های گرم‌مثبت، باسیل‌ها و اشکال خمیده گرم‌منفی و کوکوس‌های گرم‌مثبت به ترتیب 5/58، 4/38 و 1/3 درصد از جدایه‌های را در برگرفتند. همچنین، مشاهده لام رنگ‌آمیزی اسپور نشان داد که بیش از 50 درصد باسیل‌های گرم‌مثبت اسپوردار بودند. در نهایت، بر اساس ویژگی‌های فنوتیپی بررسی شده، سویه‌ها به چندین گروه تقسیم و در هر گروه سویه‌هایی با خصوصیات بسیار مشابه قرار داده شد. سپس، از میان این گروه‌ها 57 سویه به صورت تصادفی برای مطالعات بیوشیمیایی بیشتر انتخاب گردید. از این 57 سویه، ترادف‌یابی 16S rRNA برای 55 سویه صورت گرفت. جدول 3 ویژگی‌های ریخت‌شناسی، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی برای 57 سویه را نشان می‌دهد.

 

افتراق سویه‌های نمک‌دوست نسبی و تحمل‌کننده نمک: از مجموع 57 سویه منتخب، 2/63 درصد آنها نمک‌دوست نسبی و 8/36 درصد سویه‌ها تحمل‌کننده نمک بودند.

در بین سویه‌های نمک‌دوست نسبی که رشد بهینه خود را در محیط 3-15 درصد نمک دارند، در برخی سویه‌ها رشد در 25 درصد نمک هم مشاهده شد. سویه‌هایی که رشد بهینه در محیط‌های پایین‌تر از 3 درصد نمک داشتند و همچنین، توانایی رشد در محیط فاقد نمک به عنوان باکتری‌های تحمل‌کننده نمک انتخاب شدند. در باکتری‌های تحمل‌کننده نمک رشد بهینه در محیط حاوی 1 درصد نمک مشاهده شد. درصد سویه‌های نمک‌دوست نسبی و تحمل‌کننده نمک به تفکیک مناطق جداسازی آنها در شکل 3 آمده است. در هر سه منطقه میزان جدایه‌های نمک‌دوست نسبی نسبت به تحمل‌کننده نمک بیشتر است.


 

 

جدول 3- ویژگی‌های ریخت‌شناسی، فیزیولوژیک و بیوشیمیایی بررسی شده در سویه‌های منتخب

سویه

شکل سلول

رنگ کلونی

رنگ‌آمیزی گرم

KOH

حرکت

اکسیداز

کاتالاز

اسپور

موقعیت اسپور

شکل اسپور

سلول مولد

GAAx1

باسیل

کرم

-

+

+

+

-

-

-

-

GAAx7

باسیل کوتاه

کرم روشن

-

+

-

+

+

-

-

-

GAAx6

ویبریو فرم

قرمز

-

+

+

-

+

-

-

-

GAAx9

باسیل ریز

کرم-قهوه‌ای

-

+

+

+

+

-

-

-

GAAy3

کوکسی

نارنجی

+

-

-

-

+

-

-

-

GAAy5

خمیده

بی‌رنگ

-

+

+

+

+

-

-

-

GAAy6

باسیل

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GASx6

باسیل

سفید

+

-

-

-

+

انتهایی

بیضی

متورم

GASx9

باسیل

صورتی-قهوه‌ای

v

+

-

+

+

-

-

-

GASx17

باسیل ریز

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GASx19

خمیده

زرد

-

+

+

+

+

-

-

-

GASx20

خمیده

بی‌رنگ

-

+

+

+

+

-

-

-

GASx25

باسیل

کرم

+

-

+

-

+

-

-

-

GASx41

باسیل

صورتی کم‌رنگ

-

+

-

+

-

-

-

-

GASy1

باسیل

کرم

+

-

-

-

+

-

-

-

GASy9

باسیل

کرم

+

-

+

-

+

نیمه انتهایی

بیضی

متورم

GAWx1

باسیل ریز

نارنجی

-

+

-

+

-

-

-

-

GAWx3

باسیل ریز

زرد

-

+

+

+

+

-

-

-

GAWy5

باسیل

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GAWy6

باسیل

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GBFx3

باسیل

صورتی-قهوه‌ای

v

+

-

+

+

-

-

-

GBFy1

باسیل

کرم

+

-

+

-

+

انتهایی

بیضی

متورم

GBPx2

باسیل

صورتی کم‌رنگ

-

+

-

+

-

-

-

-

GBPx3

ویبریو فرم

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GBPx9

باسیل

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GBPy5

باسیل

بی‌رنگ

-

+

+

+

+

-

-

-

GBPy7

خمیده

بی‌رنگ

-

+

+

+

+

-

-

-

GBPy11

باسیل

زرد تیره

+

-

-

-

+

-

-

-

GBPy13

کوکسی

نارنجی

+

-

+

-

+

-

-

-

GBPy15

باسیل

زرد

+

-

+

+

+

-

-

-

GBPy16

باسیل

کرم

+

-

-

-

+

نیمه انتهایی

بیضی

متورم

GBSx1

باسیل ریز

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GBSx2

باسیل

کرم

-

+

-

+

+

-

-

-

GBSx4

باسیل

کرم

-

+

-

+

+

-

-

-

GBSy1

خمیده

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GBWx7

باسیل

کرم

v

+

+

+

+

-

-

-

GBWx8

باسیل

کرم

-

+

+

-

+

-

-

-

GBWx15

باسیل

کرم تیره

+

-

-

+

+

مرکزی

بیضی

متورم

GBWx29

باسیل

کرم

-

+

-

+

+

-

-

-

GBWy1

باسیل

کرم

+

-

+

-

+

-

-

-

GBWy4

خمیده

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GBWy6

خمیده

کرم تیره

-

+

+

+

+

-

-

-

GCFx1

خمیده

کرم

-

+

-

+

+

-

-

-

GCFx3

باسیل ریز

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GCFx8

باسیل کوتاه

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GCFx14

باسیل

کرم

+

-

-

+

+

مرکزی

بیضی

متورم

GCFx16

باسیل کوتاه

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GCFx20

باسیل

کرم

-

+

-

+

+

-

-

-

GCFy1

باسیل

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GCFy5

خمیده

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

GCSx7

باسیل

کرم

+

-

+

+

+

مرکزی

بیضی

متورم

GCSx17

باسیل کوتاه

کرم-زرد

+

-

-

-

+

-

-

-

GCSx21

باسیل کوتاه

زرد

+

-

-

-

+

-

-

-

GCSx25

باسیل ریز

قرمز

-

+

-

+

+

-

-

-

GCSy1

باسیل

کرم

+

-

+

-

+

-

-

-

GCWx8

باسیل

کرم-نارنجی

-

+

+

-

+

-

-

-

GCWy1

خمیده

کرم

-

+

+

+

+

-

-

-

 

   

شکل 3- درصد سویه‌های نمک‌دوست نسبی و تحمل‌کننده نمک در هر منطقه

شکل 4- فراوانی سویه‌ها بر اساس پاسخ به غلظت نمک و اسیدیته متفاوت

 

 

محدوده اسیدیته رشد سویه‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک: بیشتر سویه‌های نمک‌دوست نسبی و تحمل‌کننده نمک رشد بهینه خود را در اسیدیته 5/8-9 نشان دادند. 61 درصد سویه‌های بررسی شده تحمل‌کننده قلیا بودند و در 39 درصد جدایه‌ها رفتار قلیادوستی مشاهده شد. فراوانی جدایه‌ها در هرمنطقه با توجه به پاسخ آنها به غلظت‌های مختلف نمک و اسیدیته متفاوت در شکل 4 آورده شده است. بیشترین فراوانی در نمک‌دوست‌های تحمل‌کننده قلیا (38 درصد) و کمترین فراوانی در تحمل‌کننده‌های نمک قلیادوست (16 درصد) مشاهده شد. میزان فراوانی نمک‌دوست‌های آلکالوفیل و تحمل‌کننده‌های نمک آلکالوتلورنت، یکسان برآورد شد.

محدوده دمای رشد سویه‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک: اغلب سویه‌ها نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک محدوده دمای رشدی 0-40 درجه سانتیگراد را نشان دادند. در برخی سویه‌ها رشد در دماهای بالاتر یعنی 45 درجه سانتیگراد هم مشاهده شد.

فعالیت آنزیم‌های هیدرولازی در سویه‌های.نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک: فعالیت هیدرولازی در میان سویه‌های منتخب انجام گرفت. از 57 جدایه بررسی شده تنها در 7 سویه از باکتری‌های نمک‌دوست نسبی و تحمل‌کننده نمک فعالیت پروتئاز خارج سلولی دیده شد. فعالیت لیپازی در بیش از نیمی از جدایه‌ها نمایان شد و بیشترین فعالیت در بین آنزیم‌های بررسی شده را به خود اختصاص داد. 15 سویه واجد فعالیت آمیلازی بودند و کمترین فعالیت در آنزیم‌های هیدرولازی بررسی شده مربوط به آنزیم داکسی ریبونوکلئاز بود که تنها در سه سویه مثبت گزارش شد.

شناسایی مولکولی سویه‌های منتخب: با مقایسه توالی ژن 16S rRNA به دست آمده از سویه‌های منتخب با توالی‌های موجود در پایگاه اطلاعاتی Eztaxon، نزدیک‌ترین میکروارگانیسم شناخته شده به هر سویه مشخص گردید. از بین 55 جدایه منتخب، ترادف‌یابی ژن 16S rRNA برای 18 جدایه به صورت کامل و برای 37 جدایه به صورت نسبی و با خواندن توالی در برای رفت انجام شد. بر اساس این نتایج، 55 جدایه بررسی شده متعلق به چهار شاخه باکتریایی Actinobacteria، Bacteroidetes، Firmicutes و Proteobacteria بود. جدول 4 میزان شباهت هر سویه با نزدیک‌ترین میکروارگانیسم شناخته شده را نشان می‌دهد. بیشتر سویه‌ها به شاخه Proteobacteria متعلق بودند به طوری که، سویه‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک، شامل باسیل‌های گرم‌منفی جدا شده در این شاخه در سه رده Alphaproteobacteria، Gammaproteobacteria و Betaproteobacteria قرار گرفتند.

در رده Alphaproteobacteria جنس‌های Talassospira، Stappia، Caenispirillum، Erythrobacter، Altererythrobacter، Martelella و Nesiotobacter به دست آمد و از رده Gammaproteobacteria جنس‌های Pseudomonas، Vibrio، Halomonas، Idiomarina، Marinabacter، Saccharospirillum و Rheinheimera جدا شد. از رده Betaproteobacteria تنها جنسی که به دست آمد Achromobacter بود. سه جنس Bacillus، Halobacillus و Paenibacillus شامل باسیل‌های گرم‌مثبت و کوکوس‌های گرم‌مثبت جنس Planococcus در شاخه Firmicutes قرارگرفت. دو جدایه با اعضای جنس‌های Aeromicrobium و Jonesia در شاخه Actinobacteria قرابت داشت. تنها یک جنس Cyclobacterium از شاخه Bacteroidetes به دست آمد که شامل دو سویه باسیل گرم‌منفی بود.

همان طور که جدول 4 نشان می‌دهد، میزان شباهت ترادف 16S rRNA در دو سویه GCFx20 و GBWx7 به گونه‌های ثبت شده نزدیک، 100 درصد بود. این میزان شباهت برای 15 سویه بین 97-9/98 درصد بود که با انجام هیبریداسیون DNA-DNA با گونه‌های نزدیک و بررسی صفات فنوتیپی ممکن است در گونه جدیدی قرار گیرند. برای 8 سویه، درصد شباهت کمتر از 97 درصد نشان داده شده که بیانگر تفاوت قابل ملاحظه در سطح گونه و یا حتی جنس بین این سویه‌ها و گونه‌های ثبت شده بوده، این سویه‌ها می‌توانند بدون انجام هیبریداسیون DNA-DNA با گونه‌های نزدیک در گونه‌های جدید قرار گیرند (Stackebrandt and Woese, 1984). سویه GCWy1 با 91 درصد شباهت با گونه‌های ثبت شده در رده Gammaproteobacteria نامزد معرفی یک جنس جدید است.


 

 

جدول 4- میزان شباهت سویه‌ها منتخب با نزدیک‌ترین گونه ثبت شده در پایگاه Eztaxon

سویه

سویه‌های نزدیک

شماره دستیابی در بانک ژن

میزان شباهت (درصد)

GAAx1

Pseudomonas pachastrellae KMM 330(T)

AB125366

98.1

GAAx7

Martelella mediterranea MACL11(T)

-

97

GAAx6

Vibrio ruber VR1(T)

AF462458

99.5

GAAx9

Rheinheimera aquimaris SW-353(T)

EF076757

99.6

GAAy3

Planococcus rifietoensis M8(T)

AJ493659

99.6

GAAy5

Saccharospirillum impatiens EL-105(T)

-

95.7

GAAy6

Halomonas boliviensis LC1(T)

AY245449

99.2

GASx6

Bacillus circulans ATCC 4513(T)

AY724690

99.3

GASx9

Bacillus cohnii DSM 6307(T)

-

97

GASx17

Idiomarina zobellii KMM 231(T)

AF052741

99.7

GASx19

Idiomarina zobellii KMM 231(T)

AF052741

99.8

GASx20

Marinobacter santoriniensis NKSG1(T)

-

96.4

GASx25

Paenibacillus chungangensis CAU 9038(T)

-

97.8

GASx41

Cyclobacterium lianum HY9(T)

-

94.6

GASy1

Bacillus neizhouensis JSM 071004(T)

-

97.2

GASy9

Bacillus cohnii DSM 6307(T)

-

97

GAWx1

Altererythrobacter ishigakiensis JPCCMB0017(T)

-

98.1

GAWx3

Idiomarina zobellii KMM 231(T)

AF052741

99.8

GAWy5

Marinobacter hydrocarbonoclasticus MBIC1303(T)

AB019148

97.6

GAWy6

Halomonas andesensis LC6(T)

EF622233

99.5

GBFx3

Stappia stellulata IAM 12621(T)

D88525

99

GBFy1

Bacillus cohnii DSM 6307(T)

X76437

99.6

GBPx2

Cyclobacterium lianum HY9(T)

-

97

GBPx3

Vibrio ordalii ATCC 33509(T)

X74718

99.6

GBPx9

Halomonas sulfidaeris ATCC BAA-803(T)

AF212204

97.7

GBPy5

Pseudomonas sabulinigri J64(T)

-

95.4

GBPy7

Idiomarina fontislapidosi F23(T)

-

93.8

GBPy11

Aeromicrobium halocynthiaeKME 001(T)

FJ042789

99.7

GBPy13

Planococcus rifietoensis M8(T)

AJ493659

99

GBPy15

Jonesia quinghaiensis DSM 15701(T)

AJ626896

99.6

GBPy16

Bacillus horikoshii DSM 8719(T)

X76443

99.3

GBSx1

Idiomarina zobellii KMM 231(T)

AF052741

99.6

GBSx2

Marinobacter szutsaonensis NTU-104(T)

EU164778

98.7

GBSy1

Idiomarina fontislapidosi F23(T)

-

94.6

GBWx7

Nesiotobacter exalbescens LA33B(T)

AF513441

100

GBWx8

Marinobacter hydrocarbonoclasticus MBIC1303(T)

AB019148

99.9

GBWx15

Bacillus hwajinpoensis SW-72(T)

AF541966

99.4

GBWx29

Achromobacter marplatensis B2(T)

-

96.7

GBWy1

Bacillus horikoshii DSM 8719(T)

X76443

98.9

GBWy4

Marinobacter hydrocarbonoclasticus MBIC1303(T)

AB019148

98.4

GBWy6

Halomonas andesensis LC6(T)

EF622233

99.5

GCFx1

Caenispirillum salinarum AK4(T)

FN995238

99.4

GCFx3

Idiomarina zobellii KMM 231(T)

AF052741

99.6

GCFx8

Thalassospira profundimaris WP0211(T)

AY186195

99.4

GCFx14

Halobacillus trueperi DSM 10404(T)

AJ310149

99.7

GCFx16

Idiomarina seosinensis CL-SP19(T)

-

97.8

GCFx20

Halomonas ventosae Al12(T)

AY268080

100

GCFy1

Marinobacter lipolyticus SM19(T)

AY147906

96.5

GCFy5

Halomonas andesensis LC6(T)

EF622233

99.3

GCSx7

Bacillus vietnamensis 15-1(T)

AB099708

97.8

GCSx17

Halobacillus alkaliphilus FP5(T)

AM295006

99.3

GCSx21

Halobacillus alkaliphilus FP5(T)

AM295006

99.4

GCSx25

Erythrobacter nanhaisediminis T30(T)

FJ654473

99.6

GCSy1

Bacillus neizhouensis JSM 071004(T)

-

97

GCWx8

Marinobacter hydrocarbonoclasticus MBIC1303(T)

AB019148

99.9

GCWy1

Saccharospirillum impatiens EL-105(T)

-

91.1

 

 

رسم درخت فیلوژنتیک سویه‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک: برای سویه‌های ترادف‌یابی شده پس از هم‌راستا کردن ترادف‌ها با ترادف گونه‌های نزدیک، درخت فیلوژنتیک با الگوریتم‌های Maximum Parsimony، Maximum likelihood و Neighbor-Joining رسم شد. در مقایسه درخت‌های رسم شده، محل قرارگیری زیرشاخه‌ها و شاخه‌ها در هر سه روش با یکدیگر هم‌خوانی داشت.

درخت فیلوژنتیک سویه‌هایی که با گونه‌های متعلق به شاخه Actinobacteria قرابت دارند در شکل 5 نشان داده شده است. در شکل 6 درخت فیلوژنتیک سویه‌هایی که با گونه‌های متعلق به شاخه Bacteroidetes قرابت دارند نشان داده شده است. شکل 7 درخت فیلوژنتیک باسیل‌های گرم‌مثبت و کوکوس‌های گرم‌مثبت ترادف‌یابی شده با سویه‌های ثبت شده نزدیک به آنها در رده Firmicute را نشان می‌دهد. در شکل 8 درخت فیلوژنتیک سویه‌هایی که با گونه‌های متعلق به سه رده α-Proteobacteria،
γ-Proteobacteria و β-Proteobacteria قرابت دارند نشان داده شده است. این سویه‌ها بیشترین فراوانی را در بین جدایه‌هایی که ترادف‌یابی برای آنها انجام شده است به خود اختصاص داده‌اند.

 

 

شکل 5- دندروگرام 16S rRNA باکترهای ترادف‌یابی شده که به جنس‌های موجود در شاخه Actinobacteria قرابت نشان دادند. اعداد ذکر شده در محل انشعاب نشانگر درصد نمونه‌گیری bootstrap از 100 نمونه است. سویه Chloroflexus aurantiacusبه عنوان outgroup قرار داده شد.

 

شکل6- دندروگرام 16S rRNA باکتری‌های ترادف‌یابی شده که به جنس‌های موجود در شاخه Bacteroidetes قرابت نشان دادند. اعداد ذکر شده در محل انشعاب نشانگر درصد نمونه‌گیری bootstrap از 1000 نمونه است. سویه Kordia algicida OT-1T به عنوان outgroup قرار داده شد.

 

شکل 7- دندروگرام16S rRNA باکتری‌های ترادف‌یابی شده که به جنس‌های باسیلوس و جنس‌های وابسته و کوکوس‌های گرم‌مثبت موجود در شاخه Firmicuteقرابت نشان دادند. اعداد ذکر شده در محل انشعاب نشانگر درصد نمونه‌گیری bootstrap از 1000 نمونه است. سویه Halobacteroides halobius,X89074 به عنوان outgroup قرار داده شد.

 

 

شکل 8- دندروگرام 16S rRNA باکتری‌های ترادف‌یابی شده که به جنس‌های موجود در سه رده α-Proteobacteria، γ-Proteobacteria و β-Proteobacteria شاخه عظیم Proteobacteria قرابت نشان دادند. اعداد ذکر شده در محل انشعاب نشانگر درصد نمونه‌گیری bootstrap از 1000 نمونه است. سویه Salinimicrobium catena (DQ640642) به عنوان outgroup قرار داده شد.

 

 

 

بحث

به منظور درک چگونگی عمل جامعه میکروبی و کل اکوسیستم، به طور محض شناسایی اجزای مختلف جامعه مقدماتی‌ترین مرحله است، که نیاز به داده‌هایی در مورد عملکرد آنها، میان‌کنش و دینامیک فضایی و زمانی و شاخص‌های محیطی برای تکمیل آن دارد. گسترش الگوهای اکوسیستم بر طبق همه این اطلاعات ضروری است، اما نظر به اینکه داده‌های اولیه ارتباط‌دهنده اکثر میکروب‌ها به عملکردشان هنوز ناشناخته است، این یک هدف دراز مدت است (López-García and Moreira, 2008). شوری پایین تالاب گمیشان همچنین اسیدیته قلیایی آن، این محیط را از دیگر اکوسیستم‌های شور بررسی شده در ایران نظیر دریاچه ارومیه، دریاچه آران و بیدگل با شوری بالا و اسیدیته خنثی و دریاچه پرشور حوض سلطان متمایز می‌کند. بنابراین، امکان دستیابی به جمعیت‌های میکروبی متفاوت از سایر اکوسیستم‌های بررسی شده وجود دارد. در این پژوهش، جداسازی و شناسایی سویه‌های نمک‌دوست نسبی و تحمل‌کننده نمک قابل کشت تالاب قلیایی شور-دریایی گمیشان واقع در شمال‌شرق ایران، سنجش شد. جدایه‌های حاصل از محیط MA نظیر GAAx6، GAAx9، GAAx7، GASx9، GASx19، GASx41، GAWx1، GAWx3، GBFx3، GBPx2، GBPx9، GBSx1 و GCSx25 قرابت زیادی با گونه‌هایAeromicrobium halocynthiae، Altererythrobacter ishigakiensis، Bacillus neizhouensis، Cyclobacterium lianum، Erythrobacter nanhaisediminis، Halomonas sulfidaeris، Idiomarina zobellii، Martelella mediterranea، Rheinheimera aquimaris،Stappia stellulataو Vibrio ruber که منشأ دریایی دارند، نشان دادند. به دلیل اینکه این تالاب منشأ دریایی دارد و یک تالاب دریایی-ساحلی است چنین نتیجه‌ای قابل پیش‌بینی بود. قابل توجه است که بیشترین جدایه‌های منسوب به گونه‌های دریایی از نقطه A جداسازی شد و این منطقه در واقع نزدیک‌ترین فاصله را از نظر موقعیت جغرافیایی با دریای خزر نسبت به دو منطقه دیگر نمونه‌گیری دارد. از این رو، فراوانی بیشتر این نوع جدایه‌ها از این مکان دور از انتظار نیست.

با توجه به اسیدیته قلیایی تالاب گمیشان، استفاده از محیط‌های کشت با اسیدیته قلیایی ضروری به نظر می‌رسید و منجر به جداسازی سویه‌هایی گردید که قرابت زیادی به گونه‌های قلیادوست از قبیل قبیل Halobacillusalkaliphilus FP5(T) و Bacillus horikoshii DSM 8719(T) نشان دادند. از آنجا که گونه‌های جنس Bacillus توانایی گسترده‌ای در تولید آنزیم‌های هیدرولازی دارند، ارزیابی این سویه‌ها از نظر تولید آنزیم‌های قلیایی می‌تواند در زیست فناوری حایز اهمیت باشد.

مطالعات نشان داد که بیشترین جدایه‌ها حاصل از کشت، متعلق به باسیل‌های گرم‌مثبت (59 درصد) به ویژه باسیل‌های گرم‌مثبت اسپوردار است که چنین یافته‌ای، تأییدی بر شرایط سخت این مکان اکولوژیک متغیر و پویاست. اسپور این باکتری‌ها قابلیت مقاومت نسبت به شرایط سخت و حالت خفتگی را دارا بوده، می‌تواند شرایط سخت و نامطلوب را تحمل نماید. دلیل دیگر آن می‌تواند استفاده از محیط‌های کشت انتخابی و شرایط آزمایش باشد که منجر به جداسازی بیشتر باسیل‌های گرم‌مثبت شده است. در مطالعه باباولیان (1386)، جداسازی و شناسایی باکتری‌های نمک‌دوست نسبی بومی دریاچه نمک آران و بیدگل انجام شد و بر اساس شباهت‌های فنوتیپی در میان جدایه‌های جداسازی شده، در نهایت، 83 سویه نمک‌دوست نسبی جدا شد که 44 سویه آنها باسیل گرم‌مثبت بودند (باباولیان، 1386). همین نتیجه در بررسی‌های بعدی بر روی دریاچه آران و بیدگل با فراوانی بیشتری از باسیل‌های گرم‌مثبت به دست آمده است (دیدری خمسه مطلق، 1388؛ باقری، 1388). در مطالعه مشابهی بر روی دریاچه پرشور ارومیه نیز باسیل‌های گرم‌مثبت دارای بیشترین فراوانی بودند و 9/59 درصد جدایه‌ها را به خود اختصاص دادند (مهرشاد، 1390)، که این فراوانی به نتایج به دست آمده در پژوهش حاضر نزدیک‌تر است. در بررسی تنوع زیستی دریاچه‌های شور در مغولستان داخلی توسط Ventosa و همکاران (2006) 163 باکتری نمک‌دوست نسبی جدا شد که 102 سویه آن به جنس‌های Bacillus،Halobacillus،Oceanobacillus،Gracilibacillus، Virgibacillus، Filobacillus وThalassobacillus تعلق داشتند. اما در مطالعات مشابه توسط Ghozlan و همکاران (2006) در محیط‌های شور مصر به جداسازی 76 باکتری نمک‌دوست نسبی گرم‌منفی و 14 باکتری نمک‌دوست نسبی گرم‌مثبت منجر شد (Ghozlan et al., 2006).

در مرحله بعد باسیل‌های گرم‌منفی با 24 درصد فراوانی و اشکال خمیده که شامل سلول های ویبریوفرم و مارپیچی بود، 14 درصد جدایه‌ها را به خود اختصاص دادند. در بررسی مشابه دیگر توسط دیدری خمسه مطلق (1388) و باقری (1388) به ترتیب بر روی جدایه‌های تحمل‌کننده نمک و نمک‌دوست نسبی دریاچه شور آران و بیدگل، اشکال ویبریوفرم و مارپیچی گزارش نشده است. با توجه به این مطلب که تالاب گمیشان بر خلاف دریاچه نمکی آران و بیدگل که یک دریاچه اتالازوهالین است، یک تالاب دریایی-ساحلی است و وجود جدایه‌های گرم‌منفی ویبریوفرم و مارپیچی قابل انتظار است. بنابراین، تفاوت‌های مشاهده شده را می‌توان به ویژگی‌های متفاوت زیستگاه‌های مختلف نسبت داد و صحت این موضوع که تنوع زیستی هر زیستگاه از ویژگی‌های منحصر به فرد آن محسوب می‌شود و پژوهش روی هر محیط جدید اهمیت خاص خود را دارد، تأیید کرد. کوکوس‌های گرم‌مثبت تنها 7 درصد سویه‌ها را تشکیل دادند.

در هر سه منطقه نمونه‌برداری در تالاب گمیشان میزان جدایه‌های نمک‌دوست نسبی بیشتر بود. این حالت در منطقه C با توجه به میزان شوری سنجش شده بالاتر نسبت به دو مکان دیگر نمونه‌گیری A) و (B برجسته‌تر بود. از سوی دیگر، استفاده از محیط‌های انتخابی احتمالاً تمایل را به سمت فراوانی بیشتر باکتری‌های نمک‌دوست سوق داده است.

با توجه به اسیدیته قلیایی این اکوسیستم، جداسازی سویه‌های قلیادوست و تحمل‌کننده قلیا قابل انتظار بود. 39 درصد سویه‌های بررسی شده قلیادوست بودند، به طوری که بهینه رشد خود را در اسیدیته 9 نشان دادند و توانایی رشد در اسیدیته 10 را داشتند. 23 درصد این سویه‌ها را جدایه‌های نمک‌دوست قلیادوست تشکیل دادند. یعنی این سویه‌ها رشد بهینه خود را در دو نوع شرایط تنشی فیزیکوشیمیایی نشان دادند و می‌توان آنها را جزو باکتری‌های پلی‌اکستریموفیل در نظر گرفت. از طرف دیگر، بیشترین فراوانی مربوط به سویه‌های تحمل‌کننده قلیا بود که 38 درصد آنها هالوآلکالوتلورنت بودند و 23 درصد باقی مانده تحمل‌کننده نمک آلکالوتلورنت بودند. در بررسی تنوع زیستی باکتری‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک دریاچه ارومیه، دو سویه نمک‌دوست قلیادوست که به گونه قلیادوست Alkalibacterium putridalgicola قرابت داشتند، به دست آمد (مهرشاد، 1390). به طور کلی، 95 باکتری نمک‌دوست قلیادوست از زیستگاه‌های نمکی مختلف جدا شده است. بیشتر این سویه‌ها می‌توانند در دامنه 5-25 درصد کلرید سدیم و اسیدیته 8-10 رشد کنند. در تحقیقی Dodia و همکاران (2006) بر اساس همسانی ژن 16S rRNA، 5 سویه از 13 جدایه جدید بود در حالی که 8 سویه دیگر با بیش از 90 درصد همسانی توالی با نمک‌دوست‌ها و قلیادوست‌های متفاوت جداسازی شده از دریاچه‌های قلیایی و سایر زیستگاه‌های پرشور مختلف در سراسر کره خاکی ظاهر شدند (Dodia et al., 2006). در بررسی دیگر توسط Foti و همکاران (2008) بر روی دریاچه‌های قلیایی روسیه، هیچ یک از گونه‌های توصیف شده به واقع به عنوان نمک‌دوست قلیادوست و نمک‌دوست تحمل‌کننده قلیا تعریف نشد. سایر مطالعات بر روی دریاچه‌های قلیایی کنیا و مصر بر اساس تکنیک مستقل از کشت کلون انجام شد، سویه‌های به دست آمده به نمک‌دوست‌های قلیادوست توصیف شده وابسته بودند (Foti et al., 2008).

باکتری‌های نمک‌دوست قلیادوست در طی دهه گذشته مورد توجه شایانی بوده و هستند و به طور وسیعی تنوع فیلوژنتیک آنها بررسی شده است. اطلاعات محدودی روی پتانسیل آنزیمی و خصوصیات آنزیمی این ارگانیسم‌ها در دسترس است (Singh et al., 2006). از 57 سویه مطالعه شده از نظر وجود آنزیم‌های هیدرولیتیک 32 جدایه لیپاز، 15 جدایه آمیلاز، 7 جدایه پروتئاز و 3 جدایه DNase تولید می‌کنند. 15 سویه از نظر تولید آنزیم هیدرولازی بررسی شده فاقد فعالیت هستند. تمام سویه‌های پروتئاز مثبت (تولید‌کننده پروتئاز) از باکتری‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک تحمل‌کننده قلیا هستند. فعالیت لیپازی در بیش از نیمی از جدایه‌ها مثبت بود. جالب توجه است که 7 سویه از جدایه‌های نمک‌دوست قلیادوست به دست آمده مولد آنزیم لیپاز خارج سلولی هستند، این آنزیم‌ها می‌توانند در زیست فناوری حایز اهمیت باشند. فعالیت آنزیم آمیلاز نیز در چهار سویه نمک‌دوست قلیادوست مشاهده شد. علاوه برآن در سویه‌های تحمل‌کننده نمک قلیادوست و تحمل‌کننده قلیا نیز این آنزیم شناسایی شد. تنها در یک سویه از جدایه‌ها نمک‌دوست قلیادوست فعالیت آنزیم داکسی ریبونوکلئاز مشاهده شد. پژوهش انجام شده بر روی دریاچه حوض سلطان منجر به جداسازی 231 جدایه نمک‌دوست شد که طیف وسیعی از آنزیم‌های هیدرولازی را تولید می‌کردند و میکروارگانیسم نمک‌دوست فاقد فعالیت هیدرولیتیک مشاهده نشد. از بین آنزیم‌های مطالعه شده، 195 سویه تولید آمیلاز، 177 سویه پروتئاز، 65 سویه DNase و 28 سویه مولد لیپاز بودند. در مقایسه با نتایج حاصل از پژوهش حاضر که سویه‌های مولد آنزیم لیپاز بیشترین فراوانی را در جدایه‌های مورد بررسی دارند، باکتری‌های نمک‌دوست جدا شده مولد لیپاز از دریاچه حوض سلطان کمترین فراوانی را به خود اختصاص دادند (Rohban et al., 2009). در بررسی تنوع زیستی میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست تولید کننده آنزیم‌های هیدرولیتیک خارج سلولی در دریاچه ارومیه توسط آموزگار و همکاران (1386)، 188 جدایه نمک‌دوست جداسازی شد که از نظر تولید آنزیم‌های هیدرولازی ارزیابی شدند. 106 جدایه قادر به تولید آنزیم داکسی ریبونوکلئاز، 63 جدایه لیپاز و 57 جدایه آمیلاز و 49 جدایه پروتئاز مثبت بودند. برخلاف پژوهش حاضر که کمترین فراوانی مربوط به سویه‌های مولد داکسی ریبونوکلئاز است، در بررسی انجام شده روی جدایه‌های نمک‌دوست دریاچه ارومیه سویه‌های مولد این آنزیم بیشترین فراوانی را به خود اختصاص دادند (زهرایی، 1386).

55 سویه منتخب با توالی‌یابی 16S rRNA در 22 جنس مختلف قرار گرفتند، که به شش رده باکتریایی Actinoacteria، Bacteroidetes، Firmicutes،
α-Proteobacteria، γ-Proteobacteria و
β-Proteobacteriaتعلق داشتند و اغلب سویه‌ها به رده Gammaproteobacteria متعلق بودند و در مجموع، 23 سویه نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک در این رده قرار گرفت که شامل 11 باسیل گرم‌منفی و مابقی اشکال خمیده گرم‌منفی شامل ویبریوفرم و مارپیچی بود. باسیل‌های گرم‌منفی در جنس‌های Halomonas،Idiomarina، Marinobacter، Pseudomonas و Rheinheimera قرار گرفتند و سلول‌های مارپیچی و ویبریو فرم به چهار جنس Idiomarina، Marinobacter، Saccharospirillum و Vibrio تعلق داشتند. 15 سویه به رده Firmicutes متعلق بود که شامل 13 باسیل گرم‌مثبت و 2 کوکوس گرم‌مثبت بود. باسیل‌های گرم‌مثبت در جنس‌های Bacillus،Halobacillus و Paenibacillus قرار گرفتند و کوکوس‌های گرم‌مثبت به جنس Planococcusقرابت نشان دادند. در رده Alphaproteobacteria 8 باسیل گرم‌منفی متعلق به جنس‌های Altererythrobacter،Caenispirillum، Erythrobacter، Martelella، Nesiotobacter، Stappia و Thalassospira مشاهده شد. تنها جنسی که به رده Betaproteobacteria تعلق داشت جنس Achromobacterبود. از شاخه Actinobacteria دو باسیل گرم‌مثبت متعلق به جنس‌های Aeromicrobium و Jonesia جداسازی شد. تنها جنس جدا شده از شاخه Bacteroidetes، جنس Cyclobacterium بود که دو باسیل خمیده گرم‌منفی را به خود اختصاص داد. در مطالعه‌ باباولیان (1386)، جداسازی و شناسایی باکتری‌های نمک‌دوست نسبی بومی دریاچه نمک آران و بیدگل و توانایی این میکروارگانیسم‌ها در تولید آنزیم‌های هیدرولازی خارج سلولی بررسی شده است. بر اساس شباهت‌های فنوتیپی در میان جدایه‌های جداسازی شده، در نهایت، 83 سویه نمک‌دوست نسبی جدا شد که به جنس‌های نمک‌دوست نسبیBacillus، Thalassobacillus، Salinicoccus، Halobacillus، Halomonas،Staphylococcus،Marinococcus،IdiomarinaوSalicola قرابت داشته، بیشترین فراوانی مربوط به جنس‌های Salicola و Halobacillus گزارش گردید (باباولیان، 1386). مطالعات مشابه توسط آموزگار و همکاران (1388) بر روی دریاچه نمک آران و بیدگل انجام شد و به طور مجزا تنوع زیستی باکتری‌های نمک‌دوست نسبی و تحمل‌کننده نمک بررسی شده است. در بررسی که روی باکتری‌های تحمل‌کننده نمک دریاچه صورت گرفت، اغلب سویه‌ها به رده Firmicutesمتعلق بود و در مجموع، 41 سویه تحمل‌کننده نمک در این رده قرارگرفت که شامل 35 باسیل گرم‌مثبت و 6 کوکوس گرم‌مثبت بود. باسیل‌های گرم‌مثبت شامل جنس‌های Aneurinibacillus، Bacillus،Brevibacillus،Marinilactibacillus،Oceanobacillus،Ornithinibacillus،PaenibacillusوVirgibacillusبود.کوکوس‌های گرم‌مثبت رده Firmicutes در چهار جنس Staphylococcus، Aerococcus، Jeotgalicoccus و Salinicoccus قرار گرفت. چهار جدایه با اعضای رده Actinobacteria قرابت داشت که دو جدایه متعلق به جنس Arthrobacter و دو جدایه در جنس‌های Kocuria و Microbcterium گزارش شدند. در رده
γ-Proteobacteria سهباسیل گرم‌منفی گزارش شد که با اعضای جنس‌هایPseudomonas، Halomonas وAcinetobacterقرابت نشان دادند. یک کوکوس گرم‌منفی متعلق به جنس Paracoccus و یک باسیل گرم‌منفی متعلق به جنس Brevundimonas در رده
α-Proteobacteriaنیز گزارش شدند (دیدری خمسه مطلق، 1388). همچنین، مطالعه‌ای بر روی باکتری‌های نمک‌دوست نسبی دریاچه آران و بیدگل به جداسازی سویه‌های گرم‌مثبت که از نظر فیلوژنتیک در جنس‌های Aquisalibacillus،Bacillus،Gracilibacillus،Halobacillus،Oceanobacillus،Ornithinibacillus،Paraliobacillus،Piscibacillus،Salinicoccus،Salirhabdus،Thalassobacillusو Virgibacillus قرار می‌گرفتند، منجر شد. سویه‌های گرم‌منفی از جنس‌های Salicola،Marinobacter،Chromohalobacter، HalomonasوIdiomarina جداسازی و شناسایی شدند (باقری، 1388). بررسی تنوع زیستی باکتری‌های نمک‌دوست نسبی و تحمل‌کننده نمک سواحل غربی دریاچه ارومیه به جداسازی جدایه‌های گرم‌مثبت در جنس‌های Halobacillus، Planococcus،Gracilibacillus، Basillus،Staphylococcus،Ornithinibacillus،Alkalibacterium،Kocuria،Pontibacter،Sanguibacter،Micrococcus،Oceanobacillus،Microbacterium،Thalassobacillusو Piscibacillusو جدایه‌های گرم‌منفی در جنس‌های Halomonas،Paracoccus،Marinobacter،Providencia،Lysobacter،Pontibacter،SalicolaوBrevundimonasمنجر شد (مهرشاد، 1390).

برخلاف پژوهش حاضر، در هر چهار پژوهش تفسیر شده، باسیل‌های گرم‌مثبت بیشترین میزان فراوانی را به خود اختصاص دادند. سویه‌های جداسازی شده در این بررسی تنوع فیلوژنتیک بالاتری نسبت به مطالعات گذشته دارد و این تنوع در شش رده باکتریایی پراکنده شده است.در هیچ یک از این پژوهش‌ها جنس‌هایAchromobacter،Aeromicrobium،Altererythrobacter،Caenispirillum،Cyclobacterium،Erythrobacter،Jonesia،Martelella، Nesiotobacte، Planococcus،Rheinheimera،Saccharospirillum،Stappia،Thalassospiraو Vibrio مشاهده نشد.تعداد و تنوع نمونه‌ها، فصل‌های مختلف نمونه‌برداری، تعداد و تنوع نمونه‌های به کار گرفته شده، توزیع طبیعی میکروارگانیسم‌ها در محیط‌زیست و مشخصات اکولوژی هر منطقه همگی از جمله مواردی هستند که در نوع باکتری‌های جداسازی شده اثر خواهند داشت (Alain and Querellou, 2009). احتمال افزایش تنوع موجود با افزایش هر بار نمونه‌برداری، بدون رسیدن به آستانه‌ شناخت تنوع کامل در تعداد نمونه‌برداری امکان‌پذیر نیز در تفاوت نوع و تعداد میکروارگانیسم‌های جدا شده در هر پژوهش تأثیرگذار خواهد بود (Hughes et al., 2001).

 

 

 

 

 

 

منابع

باباولیان، ح. (1386) تنوع زیستی باکتری‌های نمک‌دوست نسبی تولید کننده آنزیم‌های هیدرولیتیک دریاچه نمک آران و بیدگل. پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه آزاد اسلامی واحد قم، قم، ایران.

باقری، م. (1388) بررسی تنوع باکتری‌های نمک‌دوست نسبی هتروتروف هوازی و قابل کشت در دریاچه آران و بیدگل. پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه تهران، تهران، ایران.

دیدری خمسه مطلق، م. (1388) بررسی تنوع باکتری‌های تحمل‌کننده نمک هوازی هتروتروف قابل کشت در دریاچه آران و بیدگل. پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه تهران، تهران، ایران.

بهروزی‌راد، ب. (1386) تالاب‌های ایران. سازمان جغرافیایی نیروی‌های مسلح، تهران.

زهرایی، ش. (1386) بررسی تنوع زیستی میکروارگانیسم‌های نمک‌دوست تولید کننده آنزیم‌های هیدرولیتیک خارج سلولی در دریاچه ارومیه. پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه تهران، تهران، ایران.

مهرشاد، م. (1390) بررسی تنوع زیستی باکتری‌های نمک‌دوست وتحمل‌کننده نمک سواحل غربی دریاچه ارومیه. پایان‌نامه کارشناسی ارشد، دانشگاه تهران، تهران، ایران.

Alain, K. and Querellou, J. (2009) Cultivating the uncultured: limits, advances and future challenges. Extremophiles. 4: 583-594.

Amoozegar, M. A., Malekzadeh, F. and Malik, K. A. (2003) Production of amylase by newly isolated moderate halophile Halobacillus sp. Strain MA-2. Microbiology Methods 52: 353-359.

Amoozegar, M. A., Schumann, P., Hajighasemi, M. and Fatemi, A. Z. (2008) Salinivibrio proteolyticus sp. nov. a moderately halophilic and proteolytic species from a hypersaline lake in Iran. International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology 58: 1159-1163.

Atlas, R. M. and Bartha, R. (1998) Microbial ecology: fundamentals and applications. 4th edition. Addison-Wesley. California.

Caton, T. (2004) Halotolerant aerobic heterotrophic bacteria from the Great Salt Plains of Oklahoma. Microbial Ecology 4: 449-462.

Dodia, M. S., Patel, R. K., Rupal, H., Joshi, R. H., Patel, B. K. C. and Singh, S. P. (2006) Diversity and molecular phylogeny of the haloalkaliphilic bacteria isolated from Western coast of India. The sixth International Congress on Extremophiles. Brest, France.

Foti, M. J., Sorokin, D. Y., Zacharova, E. E., Pimenov, N. V., Kuenen, J. G. and Muyzer, G. (2008) Bacterial diversity and activity along a salinity gradient in soda lakes of the Kulunda Steppe (Altai, Russia). Extremophiles 12: 133-145.

Gerhardt, P. and Murray, R. G. E. (1994) Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology. Washington.

Ghozlan, H., Deif, H., Kandil, R. A. and Sabry S. (2006) Biodiversity of moderately halophilic bacteria in hypersaline habitats in Egypt. The Journal of General and Applied Microbiology 52: 63-72.

Grant, W. D. (1992) Hypersaline environments. Proceedings of the Sixth International Symposium on Microbial Ecology. Barcelona, Spain.

Hughes, J. Hellmann, J. Ricketts, T. H. and Bohannan B. J. M. (2001) Counting the uncountable: statistical approaches to estimating microbial diversity. Applied Environmental Microbiology 10: 4399-4406.

Kamekura, M. (1998) Diversity of extremely halophilic bacteria. Extremophiles 2: 289-295.

Kushner, D. J. and Kamekura, M. (1988) physiology of halophilic eubacteria. CRC press, Boca Raton.

López-García, P. and Moreira D.(2008) Tracking microbial biodiversity through molecular and genomic ecology. Research in Microbiology 1: 67-73.

Makhdoumi Kakhki, A., Amoozegar, M. A., Kazemi, B., Paši, L. and Ventosa, A. (2012) Prokaryotic diversity in Aran-Bidgol salt lake, the largest hypersaline playa in Iran. Microbes and Environments 1: 87-93.

Martin, S., Marquez, M., Sanchez-Porro, C., Mellado, E., Arahal, D. R. and Ventosa, A. (2003) Marinobacter lipolytic sp. nov. a novel moderate halophile with lipolytic activity. International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology 53: 1383-1387.

Oren, A. (1994) The ecology of the halophilic archaea. Federation of European Materials Societies Microbiology 13: 415-440.

Oren, A. (2002a) Halophilic microorganisms and their environments. Kluwer Scientific Historical Survey, Dordrecht.

Oren, A. (2002b) Molecular ecology of extremely halophilic archaea and bacteria. Federation of European Materials Societies Microbiology 1: 1-7.

Rodriguez-Valera, F. (1993) Introduction to saline environments. The biology of halophilic bacteria. CRC Press Incorporation. Boca Raton.

Rohban, R., Amoozegar, M. A. and Ventosa, A. (2009) Screening and isolation of halophilic bacteria producing extracellular hydrolyses from Howz Soltan Lake, Iran. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology Official Journal of the Society for Industrial Microbiology 36: 333-340.

Ronald, M. (2005) Media for environmental microbiology. 2nd edition, Taylor and Francis Group, Boca Raton.

Simbert, R. M. and Krieg, N. R. (1994) phenotypic characterization. In: Methodes for general and molecular bacteriology (eds. Gerhard, P., Murray, R. G. E., Wood, W. A. and Krieg, N. R.) 607-655. American Society for Microbiology, Washington.

Singh, S. P., Dodia, M. S. and Joshi, R. H. (2006) Diversity among haloalkaliphilic bacteria isolated from Western India with respect to the occurrence and properties of extracellular alkaline proteases. The sixth International Congress on Extremophiles. Brest, France.

Spencer, J. F. T. and Ragout de Spencer, A. L. (2004) Environmental microbiology: methods and protocols. Humana Press Incorporation, New Jersey.

Stackebrandt, E. and Woese, C. R. (1984) The phylogeny of prokaryotes. Microbiological sciences 5: 117-122.

Tamura, K. and Dudley, J. (2007) MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology and evolution 8: 1596-1599.

Ulukanli, Z. (2002) Alkaliphilic micro-organisms and habitats. Turkish Journal of Biology 26: 181-191.