حفظ چندشکلی نشانگرهای ژن GJB2 در جمعیت ایرانی به واسطه انتخاب متعادل

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

2 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران و؛ گروه ژنتیک پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران

چکیده

ژن GJB2 کانکسین26 را که یک پروتئین رابط بین سلولی مهم در پوست است، کد می‌کند. کانکسین 26 یک پروتئین سرتاسری غشاء است که در مسیر بازسازی یون پتاسیم در گوش داخلی نقش دارد. در این مطالعه، آزمون‌های خنثی (neutrality) بر روی اطلاعات ژنوتیپی به دست آمده از سه نشانگر چندشکلی SNP1245، D13S141 و D13S175 واقع در ناحیه ژن GJB2 اجرا شد. مجموعه برنامه‌های کامپیوتری آنالیز ژنتیک جمعیت، PyPop و Popgene32، برای آنالیز اطلاعات به دست آمده از جمعیت ایرانی استفاده شد. ارزش Fnd سه نشانگر SNP1245، D13S141 و D13S175 در جمعیت ایرانی به ترتیب 5980/0-، 0155/1- و 6457/0- ولی بدون ارزش معنی‌دار P تخمین زده شد که بیانگر تأثیر انتخاب متعادل بر روی نشانگرهای چندشکلی در ژن GJB2 است. در جمعیت مطالعه شده، ارزش F هر سه نشانگر چندشکلی در داخل ناحیه L95 و U95 ارزش F مورد انتظار واقع شده است که نشان‌دهنده عدم تأثیر ناکارآمدی (hitchhiking) ژنتیکی بر روی نشانگرهای ناحیه ژنی GJB2 است. نتایج به دست آمده از این مطالعه بیانگر آن است که چندشکلی این سه نشانگر در ژن GJB2 به واسطه ارزش سازگاری بالاتر هتروزیگوت‌ها در جمعیت ایرانی حفظ شده است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Conservation of polymorphism in GJB2 gene markers in Iranian population by balancing selection

نویسندگان [English]

  • Halimeh Rezaei 1
  • Zahra Fazeli Attar 2
  • Marjan Mojtabavi Naeini 1
  • Sadeq Vallian Boroujeni 1
1 Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Isfahan, Isfahan, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Sciences, University of Isfahan, Isfahan, Iran & Department of Genetics, Faculty of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran
چکیده [English]

GJB2 gene encodes connexin 26 which is an important skin-expressed gap junction protein. Connexin 26 is a transmembrane protein that is involved in the potassium ion recycling pathway in the inner ear. In this study, the neutrality tests were performed on genotyping data obtained from three polymorphic markers SNP1245, D13S141 and D13S175, located within the GJB2 region. The population genetics analysis packages, PyPop and Popgene32, were used for the analysis of the data obtained from Iranian population. Fnd value of three markers, SNP1245, D13S141 and D13S175, in Iranian population was estimated -0.5980, -1.0155 and -0.6457, respectivelybut without significant P values. The results indicated the influence of balancing selection on polymorphic markers at GJB2 gene. In the studied population, the F value of three markers lied inside L95 and U95 region of expected F value which showed no effect of genetic hitchhiking on markers located within GJB2 region. The results obtained from this study indicated that the polymorphism of these three markers in GJB2 gene was maintained by higher adaptive value of heterozygotes in Iranian population.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Neutrality test
  • Balancing selection
  • Iranian population
  • GJB2 gene

مقدمه

در مطالعه‌ای که به تازگی بر روی جمعیت ناشنوایان ایرانی صورت گرفته است، شیوع آلل‌های جهش یافته ژن GJB2 در بیماران مبتلا به ناشنوایی در ایران 9/19 درصد گزارش شده است. به نظر می‌رسد که جهش‌های ژن GJB2 در جمعیت ناشنوای ایرانی همانند بسیاری از جمعیت‌های دنیا شیوع بالایی دارد (Daneshi et al., 2011). ژن پروتئین اتصالات شکاف بتا-2 (GJB2) شایع‌ترین ژن عامل بروز فقدان شنوایی توارثی غیرسندرومی در گروه‌های قومی مختلف است Zelante et al., 1997)؛ Estivill et al., 1998؛ (Kelley et al., 1998. کانال‌های اتصال شکاف، سیتوپلاسم سلول‌های مجاور را به هم متصل می‌کند و امکان انتشار یون‌ها و متابولیت‌های کوچک را فراهم می‌سازد Bruzzone et al., 1996)؛ Martinez et al., 2009). مشخص شده است که پروتئین GJB2 اتصالات شکاف بین سلول‌های بافت اپی‌تلیال و پیوندی در حلزون گوش را تشکیل می‌دهد و در بازسازی یون‌های پتاسیم درون لنف، مؤثر در فرآیند انتقال صدا، نقش دارد (Kikuchi et al., 1995).

مشخص شده است که افراد هموزیگوت و هتروزیگوت برای جهش شایع ژن GJB2 در آفریقا، R143W، پوست برونی ضخیم‌تر و ترشح بیشتری از کلرید و سدیم در عرق نسبت به سایر افراد سالم خانواده دارند. این مشاهدات پیشنهاد کننده آن است که فنوتیپ‌های پوست بیرونی که همراه با جهش‌های ژن GJB2 است، ممکن است مکانیسم حفاظتی در برابر تهاجم پاتوژن‌ها را فراهم سازد (Meyer et al., 2002). بررسی جهش‌های M34T، W44C و R143W در ژن GJB2 آشکار ساخته است که جهش‌های ژن GJB2 می‌تواند بقا سلول را در برابر عوامل عفونی افزایش دهد (Common et al., 2004). مطالعات آزمایشگاهی نشان داده است که سلول‌های بیان‌کننده جهش R143W در مقایسه با سلول‌های وحشی، حساسیت کمتری نسبت به تهاجم سلولی پاتوژن Shigella flexneri دارند (Man et al., 2007). نتایج بررسی‌های متعدد باز شدن کانکسین 26 توسط باکتری شیگلا (Shigella) را تأیید می‌کند که ممکن است در پیشرفت تهاجم باکتریایی نقش داشته باشد (Tran et al.,2003). به نظر می‌رسد که حاملین جهش‌های ژن GJB2 مزیت هتروزیگوتی مشابه با مزیت هتروزیگوسیتی حاملین جهش‌های ژن CFTRدارند. جهش‌های ژن CFTR می‌تواند تهاجم سالمونلا تیفی (Salmonella) را به سلول‌های اپی‌تلیال محدود کند و باعث حفاظت در برابر تب تیفوئید گردد Pier et al., 1998)؛ Adamo et al., 2009).

در این بررسی، آزمون‌های neutrality بر روی اطلاعات ژنوتیپی به دست آمده از مطالعه جمعیت ایرانی برای سه نشانگر چندشکلی SNP1245، D13S175 و D13S141که در ناحیه ژنی GJB2 قرار دارند، اجرا شد. نتایج این مطالعه می‌تواند درک ما را از نقش انتخاب بر روی ژنGJB2 در جمعیت ایرانی افزایش دهد.

 

مواد و روش‌ها

نمونه خون: این مطالعه بر روی 100 فرد غیرخویشاوند سالم از افراد مراجعه کننده به مرکز ژنتیک پزشکی اصفهان انجام شد. این افراد به صورت تصادفی ساده از استان‌های اصفهان، چهارمحال و بختیاری، اهواز، تهران، تبریز و یزد انتخاب شدند که به عنوان نمونه‌ای از جمعیت ایرانی مورد مطالعه قرار گرفتند. از هر فرد، 10 میلی‌لیتر خون بر روی محلول EDTA جمع‌آوری شد.

تعیین ژنوتیپ: ژنوتیپ نشانگرهای SNP1245، D13S175 و D13S141 بر روی نمونه DNA ژنومی افراد مطالعه شده با استفاده از روش PCR با پرایمرهای اختصاصی انجام شد. محصولات PCR بر روی ژل پلی‌اکریل آمید 12 درصد تفکیک شدند سپس اندازه قطعات با مقایسه با نشانگرهای اندازه تعیین شدند. توالی پرایمرها و شرایط واکنش PCR در منبع Rezaei و Vallian (2011) توضیح داده شده است.

تحلیل آماری نتایج: اطلاعات ژنوتیپی افراد سالم برای تهیه فایل ورودی در دو نرم‌افزار Popgene32 و PyPop برای مطالعه جمعیتی استفاده شد. ارزش هموزیگوسیتی مشاهده شده (F)، حد پایین اطمینان 95 درصد (L95) و حد بالای اطمینان 95 درصد (U95)، ارزش هموزیگوسیتی مورد انتظار (F^) و انحراف نرمال هموزیگوسیتی (Fnd) برای هر کدام از نشانگرها به طور جداگانه با استفاده از برنامه‌های Popgene32 نسخه 31/1 (www.ualberta.ca) و PyPop (Lancaster et al., 2003) تخمین زده شدند.

 

مشاهدات

تکثیر ناحیه مربوط به نشانگر SNP1245 قطعه‌ای با طول 289 جفت باز تولید کرد. در صورتی که نوکلئوتید T در موقعیت 1245 وجود داشته باشد، هضم آنزیمی با آنزیم BanI تولید باندهای 245 و 44 جفت باز را می‌کند. نوکلئوتید C در موقعیت 1245 یک جایگاه اضافی برای هضم آنزیمی با آنزیم BanI را ایجاد کرد و در نتیجه سه باند 148، 97 و 44 جفت باز را تولید می‌کند. برای نشانگرهای D13S141 و D13S175 به ترتیب 4 و 7 آلل مختلف در جمعیت موردمطالعه مشاهده شد. آزمون neutrality با استفاده از اطلاعات ژنوتیپی برای نشانگرهای SNP1245، D13S175 و D13S141 واقع در ناحیه ژنی GJB2 اجرا شد. نتایج به دست آمده با برنامه Popgene32 و PyPop به ترتیب در جدول‌های 1 و 2 نشان داده شده است. ارزش F برای هر سه نشانگر مطالعه شده در حدواسط L95 و U95 قرار داشت (جدول 1). ارزش F برای هر سه نشانگر مورد مطالعه کوچکتر از ارزش F^ محاسبه گردید و ارزش Fnd هم برای نشانگرهای SNP1245، D13S141 و D13S175 در جمعیت ایرانی به ترتیب 5980/0-، 0155/1- و 6457/0- ولی بدون ارزش معنی‌دار p تخمین زده شد (جدول 2). نتایج حاصل از اجرا آزمون‌های neutrality بر روی سه نشانگر مطالعه شده در این تحقیق بیانگر آن است که احتمالاً این سه نشانگر در جمعیت ایرانی تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارند.

جدول 1- تخمین مقدار هموزیگوسیتی مشاهده شده، حد پایین اطمینان 95 درصد و حد بالای اطمینان95 درصد برای نشانگرهای SNP1245، D13S141 و D13S175 در جمعیت ایرانی با استفاده از برنامه Popgene32. K=تعداد آلل‌ها،F= هموزیگوسیتی مشاهده شده، L95= حد پایین اطمینان 95 درصد، U95= حد بالای اطمینان 95 درصد.

U95

L95

F

k

جایگاه ژنی

9901/0

5024/0

7312/0

2

SNP1245

9413/0

3204/0

4220/0

4

D13S141

7708/0

2204/0

3255/0

7

D13S175

جدول 2- تخمین مقدار هموزیگوسیتی مشاهده شده، هموزیگوسیتی مورد انتظار و انحراف نرمال هموزیگوسیتی نشانگرهای SNP1245، D13S141 و D13S175 در جمعیت ایرانی با استفاده از برنامه PyPop. Fnd= انحراف نرمال هموزیگوسیتی،
F= هموزیگوسیتی مشاهده شده، F^= هموزیگوسیتی موردانتظار.

ارزش P

Fnd

F^

F

جایگاه ژنی

2842/0

5980/0-

8314/0

7312/0

SNP1245

1705/0

0155/1-

6102/0

4220/0

D13S141

3096/0

6457/0-

4229/0

3255/0

D13S175

 

بحث و نتیجه‌گیری

در مطالعه‌ای که بر روی جمعیت اصفهان صورت گرفته است، مشخص شده است که هاپلوتیپ‌های نشانگرهای BglII-EcoRI در ژن فنیل‌آلانین هیدروکسیلاز (PAH) در جمعیت اصفهان تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارند (Fazeli and Vallian, 2010). پس از آن، به منظور افزایش آگاهی در مورد ساختار ژنتیکی جمعیت‌های ایرانی، اثر انتخاب بر روی سه نشانگر واقع در ناحیه ژنی GJB2 بررسی شد. نشانگرهای SNP1245، D13S141 و D13S175 به ترتیب در ناحیه پروموتوری، انتهای سانترومری و تلومری ژن GJB2 قرار دارند.

با استفاده از اطلاعات ژنوتیپی 100 فرد غیرخویشاوند، ارزش F (هموزیگوسیتی مشاهده شده) هر سه نشانگر SNP1245، D13S175 و D13S141 محاسبه گردید. همان طور که در جدول 1 مشاهده می‌شود، ارزش F محاسبه شده در حد پایین اطمینان 95 درصد (L95) و حد بالای اطمینان 95 درصد (U95) ارزش F مورد انتظار قرار داشت. در صورتی که ارزش F خارج از مقدار حدواسط L95 و U95 قرار داشته باشد، نشانگر مورد بررسی تحت hitchhiking ژنتیکی قرار خواهد داشت و نیروی انتخاب مؤثر بر روی نشانگر یا جایگاه ژنی دیگر بر روی فراوانی آللی و هتروزیگوسیتی نشانگر مورد مطالعه تأثیر خواهد گذاشت. بر اساس نتایج به دست آمده از برآورد ارزش F نشانگرهای مطالعه شده با نرم‌افزار Popgene32، به نظر نمی‌رسد که این سه نشانگر چندشکلی در جمعیت ایرانی تحت تأثیر hitchhiking ژنتیکی قرار داشته باشند.

مقدار هموزیگوسیتی مشاهده شده (F)، هموزیگوسیتی موردانتظار (F^) و انحراف نرمال هموزیگوسیتی (Fnd) سه نشانگر SNP1245، D13S141 و D13S175 در جمعیت ایرانی با نرم‌افزار Pypop تخمین زده شد. همان طور که در جدول 2 مشاهده می‌شود، ارزش F محاسبه شده برای نشانگرهای مطالعه شده در این تحقیق کوچکتر از ارزش F^ است و ارزش Fnd نیز منفی است. در صورتی که F>F^ باشد و ارزش Fnd نیز عددی مثبت باشد، می‌توان نتیجه گرفت که نشانگر یا جایگاه ژنی موردمطالعه تحت تأثیر انتخاب جهت‌دار قرار دارد. ارزش Fnd منفی و F<F^ بیانگر آن است که نشانگر یا جایگاه ژنی مطالعه شده در جمعیت تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارد. نتایج آزمون neutrality سه نشانگر چندشکلی ژن GJB2 که با نرم‌افزار Pypop به دست آمده است، اشاره بر آن دارد که نشانگرهای موردمطالعه در این تحقیق در جمعیت ایرانی تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارند.

موانع جمعیتی، فرآیندهای تکاملی هستند که مانع تولید مثل درصد بالایی از جمعیت می‌گردند. موانع جمعیتی می‌تواند باعث افزایش درون زادآوری یا اثر بنیان‌گذار گردد که معمولاً باعث کاهش هتروزیگوسیتی می‌گردد. هتروزیگوسیتی مشاهده شده نشانگر D13S175 در جمعیت موردمطالعه 53 درصد برآورد شده است. از میان 7 آلل مشاهده شده برای نشانگر D13S175 در جمعیت ایرانی آلل 3 بالاترین فراوانی را نشان می‌دهد و فراوانی تقریباً برابر با 5/0 دارد. از میان 53 درصد افراد هتروزیگوت مشاهده شده، 42 درصد افراد مورد مطالعه برای آلل 3 هتروزیگوت بودند. به نظر می‌رسد، ژنوتیپ هتروزیگوت برای آلل 3 نشانگر D13S175 در جمعیت ایرانی، سازگاری زیستی و تولید مثلی بالاتری نسبت به سایر ژنوتیپ‌ها به افراد می‌دهد. نتایج حاصل از اجرای آزمون neutrality بر روی نشانگر D13S175 (جدول 2) نیز تأییدکننده اثر انتخاب متعادل بر روی این نشانگر است. در مورد نشانگر D13S141، هتروزیگوسیتی مشاهده شده در جمعیت ایرانی به میزان 60 درصد برآورد شده است. آلل 2 در مقایسه با سایر آلل‌های مشاهده شده برای نشانگر D13S141 فراوانی بالای 5/0 نشان می‌دهد که 56 درصد افراد مطالعه شده برای آلل 2 هتروزیگوت هستند. به نظر می‌رسد که هتروزیگوت بودن برای آلل 2 نشانگر D13S141 نیز همانند ژنوتیپ هتروزیگوت برای آلل 3 نشانگر D13S175 مزیت زیستی بالاتری را به افراد اعطا می‌کند. این نتایج با نتایج آزمون neutrality نشانگر D13S141 همخوانی دارد (جدول 2).

اگر چه هتروزیگوسیتی مشاهده شده برای نشانگر SNP1245 در جمعیت ایرانی موردمطالعه بسیار پایین و تقریبا 24 درصد برآورد می‌شود، نتایج آزمون neutrality نشانگر SNP1245 بیانگر آن است که افراد هتروزیگوت با ژنوتیپ C/T در جمعیت ایرانی سازگاری زیستی بالاتری نسبت به افراد هموزیگوت دارند.

نتایج به دست آمده در این پژوهش، حاکی از تأثیر انتخاب متعادل بر روی نشانگرهای SNP1245، D13S141 و D13S175 ژن GJB2 در جمعیت ایرانی است. به نظر می‌رسد که چندشکلی نشانگرهای ژن GJB2در جمعیت ایرانی توسط انتخاب متعادل حفظ می‌شود.

منابع

Adamo, P. D., Guerci, V. I., Fabretto, A., Faletra, F., Grasso, D. L., Ronfani, L., Montico, M. and Morgutti, M. (2009) Does epidermal thickening explain GJB2 high carrier frequency and heterozygote advantage?. European Journal of Human Genetics 17: 284-286.

Bruzzone, R., White, T. and Paul, D. (1996) Connections with connexins: the molecular basis of direct intercellular signaling. European Journal Biochemistry 238: 1-27.

Common, J. E., Davies, D. and Kelsell, D. P. (2004) Further evidence for heterozygote advantage of GJB2 deafness mutations: a link with cell survival. Journal of Medical Genetics 41: 573-575.

Daneshi, A., Hassanzadeh, S., Emamdjomeh, H., Mohammadi, SH., Arzhangi, S., Farhadi, M. and Najmabadi, H. (2011)Prevalence of GJB2-associated deafness and outcomes of cochlear implantation in Iran. Journal of Laryngology and Otology 31: 1-5.

Estivill, X., Fortina, P. and Surrey, S. (1998) Connexin-26 mutations in sporadic and inherited sensorineural deafness. Lancet 351: 394-398.

Fazeli, Z. and Vallian, S. (2010) Evidences for balancing selection from PAH-BglII and PAH-EcoRI polymorphisms in Isfahan population. Journal of Taxonomy and Biosystematics 1(1): 73-80.

Kelley, P., Harris, D. and Comer, B. (1998) Novel mutations in the connexin 26 gene (GJB2) that cause autosomal recessive (DFNB1) hearing loss. American Journal of Human Genetics 62: 792-799.

Kikuchi, T., Kimura, R. and Paul, D. (1995) Gap junctions in the rat cochlea: immunohistochemical and ultrastructural analysis. Anatomy and embryology 191: 101-118.

Lancaster, A., Nelson, M. P., Single, R. M., Meyer, D. and Thomson, G. (2003) PyPop: a software framework for population genomics: analyzing large-scale multi-locus genotype data. Pacific Symposium on Biocomputing8: 514-525.

Man, Y. K., Trolove, C. and Tattersall, D. (2007) A deafness-associated mutant human connexin 26 improves the epithelial barrier in vitro. Journal of Membrane Biology 218: 29-37.

Martinez, A., Acuna, R. and Figueroa, V. (2009) Gap-junction channels dysfunction in deafness and hearing loss. Antioxidant and Redox Signaling 11: 309-322.

Meyer, C. G., Amedofu, G. K., Brandner, J. M., Pohland, D., Timmann, C. and Horstmann, R. D. (2002) Selection for deafness?. Nature Medicine 8: 1332-1333.

Pier, G. B., Grout, M. and Zaidi, T. (1998) Salmonella typhi uses CFTR to enter intestinal epithelial cells. Nature 393: 79-82.

Tran, V. N., Hieu, G., Clair, C., Bruzzone, R. (2003) Connexin-dependent inter-cellular communication increases invasion and dissemination of Shigella in epithelial cells. Nature Cell Biology 5: 720-726.

Rezaei, H. and Vallian, S. (2011) BanI/D13S141/D13S175 Represents a novel informative haplotype at the GJB2 gene region in the Iranian population. Cellular and Molecular Neurobiology 5: 749-754.

Zelante, L., Gasparini, P. and Estivill, X. (1997) Connexin26 mutations associated with the most common form of nonsyndromic neurosensory autosomal recessive deafness (DFNB1) in Mediterraneans. Human Molecular Genetics 6: 1605-1609.