شناسایی گونه‌های جدیدی از دی‌ازوتروف‌های اندوفیت همیار برنج و گندم با استفاده از آنالیز ژن 16S rDNA و FTIR

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه گیلان، رشت، ایران

2 گروه زیست‌شناسی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

چکیده

در این مطالعه شش جدایه اندوفیت، شامل سه جدایه از ریشه سه رقم برنج (جدایه‌های PxR1، PxR2 و StR1) و سه جدایه از ریشه سه رقم گندم (جدایه‌های PxW1، PxW2 و PxW3) جداسازی و با استفاده از آزمایش فنوتیپی، شامل طیف‌سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FTIR) و همچنین، آنالیز ژنوتیپی نظیر PCR ژن 16S rDNA، تمام جدایه‌ها به غیر از جدایه StR1 Pseudoxanthomonas شناسایی شدند. مقایسه روش‌های یاد شده نشان داد که دو جدایه برنج PxR1) و (PxR2 و همچنین دو جدایه گندم PxW1) و (PxW2 به یکدیگر شبیه و جزو یک گونه و آن هم گونه جدیدی از Pseudoxanthomonas محسوب می‌شوند، در حالی که به نظر می‌رسد جدایه PxW3 جزو گونه‌ای دیگر از این جنس باشد. جدایه StR1 نیز گونه جدیدی از Stenotrophomonas است. در ابتدا تصور بر این بود که جدایه‌های مزبور جزو جنس Azospirillum هستند، لذا دو سویه Azospirillum Brasilense Sp7 (S1) و Azospirillum lipoferum (S2) به عنوان سویه‌های استاندارد انتخاب و با جدایه‌های مورد مطالعه مقایسه شدند، اما آنالیزهای فنوتیپی و ژنوتیپی تأیید کرد که این باکتری‌ها Azospirillum نیستند. برای نخستین بار در این مطالعه نشان داده شد که Pseudoxanthomonas به صورت اندوفیت در ریشه برنج وجود دارد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Identification of novel spp. of rice and wheat endophytic diazotrophs by 16S rDNA gene and FTIR analysis

نویسندگان [English]

  • Mohammad Javad Mehdipour Moghaddam 1
  • Giti Emtiazi 2
  • Majid Bouzari 2
  • Zivar Salehi 1
1 Deparment of Biology, Faculty of Sciences, University of Guilan, Rasht, Iran
2 Deparment of Biology, Faculty of Sciences, University of Isfahan, Isfahan, Iran
چکیده [English]

In this research, six isolates, including three from three rice roots (PxR1, PxR2 and StR1) and three from three wheat roots (PxW1, PxW2 and PxW3) were isolated as endophytic bacteria and except for StR1, all the isolates were identified as Pseudoxanthomonas based on phenotypic analysis including FTIR and PCR amplification of 16S rDNA. The results showed that PxR1, PxR2, PxW1 and PxW2 were all similar and belonged to a novel species of Pseudoxanthomonas, but PxW3 was from different species. StR1 belonged to a novel species of Stenotrophomonas. Two strains including Azospirillum brasiliense Sp7 (S1) and Azospirillum lipoferum (S2) were selected as standard strains and compared with those isolates however, phenotypic and genotypic analysis verified that those isolates were not Azospirillum. For the first time, it was indicated that Pseudoxanthomonas existed as an endophytic bacterium in rice root.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Endophyte
  • Rice
  • Wheat
  • Azospirillum
  • Pseudoxanthomonas
  • Stenotrophomonas

مقدمه
دو جنس Pseudoxanthomonas و Stenotrophomonas به خانواده Xanthomonadaceae تعلق دارند. اعضای جنس Pseudoxanthomonas، شامل باسیل‌های هوازی، گرم منفی، غیراسپوردار بوده، از لحاظ رده‌بندی بر اساس خصوصیات شیمیایی، دارای اسیدهای چرب غیراشباع و شاخه‌دار از نوع ایزو/آنتی و نیز اسیدهای چرب 3-OH هستند و همچنین، دارای یوبی‌کوئینون با 8 واحد ایزوپرن (Q-8) هستند. اطلاعات اندکی در ارتباط با این جنس وجود دارد و تا سال 2011 اکثر مطالعات مربوط به گونه‌های این جنس در حیطه بررسی خصوصیات فنوتیپی و رده‌بندی
بر اساس خصوصیات شیمیایی و همچنین فیلوژنتیکی
(بر اساس آنالیز توالی 16S rRNA) است (Young et al., 2007).
جنس Stenotrophomonas نیز نخستین بار همراه با Pseuodoxanthomonas maltophiila در سال 1961 معرفی شده است. در مطالعه اخیر تمام Pseudomonasها به 5 گروه از لحاظ تشابه rRNA بر اساس هیبریداسیون DNA یا rRNA تقسیم‌بندی شده‌اند. تاکنون 8 گونه Stenotrophomonas شناسایی شده است (Hayward et al., 2009). این باکتری‌ها گرم‌منفی، میله‌ای‌شکل، با مقدار G+C بالا در DNA‌ هستند. یوبی‌کوئینون‌ها با 8 واحد ایزوپرنی در تمام گونه‌های این جنس وجود دارد (Hayward et al., 2009).
باکتری‌های جنس Azospirillum نیز متعلق به خانواده Spirillaceae، زیررده آلفاپروتئوباکتری‌ها هستند. گونه‌های Azospirillum، باکتری‌های هتروتروف هوازی (حدود یک درصد از هتروتروف‌های هوازی خاک)، گرم‌منفی تا گرم‌‌متغیر، کوتاه، میله‌ای و کمی خمیده بوده که تحت شرایط میکروآئروفیلیک، ازت مولکولی را تثبیت می‌کنند. مطالعات فیلوژنتیک مولکولی 16S rDNA نشان داده است که تاکنون 11 گونه از این جنس وجود دارد (Young et al., 2008).
در طیف‌سنجی مادون قرمز، طول موج و شدت جذب نور مادون قرمز توسط نمونه اندازه‌گیری می‌شود. فرکانس تشعشع الکترومغناطیس در ناحیه مادون قرمز مطابق با فرکانس ارتعاش طبیعی اتم‌های یک پیوند است و پس از جذب امواج مادون قرمز در یک مولکول، باعث ایجاد یک سری حرکات ارتعاشی در آن می‌شود که اساس و مبنای طیف‌سنجی مادون قرمز را تشکیل می‌دهد. نخستین بار Naumann و همکاران (1994) از روش طیف‌سنجی مادون قرمز برای شناسایی میکروارگانیسم‌ها استفاده نمودند. از این روش برای شناسایی بسیاری از باکتری‌ها در سطح جنس نظیر Listeria و Staphylococcus و همچنین، در سطح گونه برای باکتری‌هایی نظیر Pseudomonas و Bacillus و همچنین، برای شناسایی مخمرها و قارچ‌ها نیز استفاده شده است. همچنین، از این روش برای شناسایی باکتری‌ها در سطح سویه نیز استفاده شده است (Goodacre et al., 1998; Kummerle et al., 1998; Tindall et al., 2000).
هدف از این مطالعه، جداسازی و شناسایی باکتری‌های دی‌ازوتروف‌ (باکتری‌های تثبیت‌کننده ازت) اندوفیت بومی از دو گیاه برنج و گندم و شناسایی آنها با استفاده از روش‌های فنوتیپی مثل طیف‌سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه و روش‌های ژنوتیپی مثل PCR ژن 16S rDNA بوده است.

مواد و روش‌ها
جداسازی اندوفیت‌های بومی از ریشه‌های برنج و گندم
نمونه‌های ریشه تازه از سه رقم گندم (گلستان، شیرازی و سفیدمحلی) و سه رقم برنج (طارم، خزر و هاشمی) در استان گیلان فراهم شدند. نمونه‌های ریشه (تارهای کشنده) به منظور جداکردن ذرات خاک متصل به سطح ریشه به مدت 20 دقیقه با آب شیر شستشو شدند. ریشه‌های شسته شده با محلول هیپوکلریت‌سدیم 5/0 درصد به مدت 30 دقیقه استریل سطحی شدند. ریشه‌ها حداقل 3 بار با آب مقطر استریل آبکشی و سپس به قطعات 5 تا 8 میلی‌متری بریده شدند. قطعات پس از فشرده‌شدن با پنس استریل، به لوله‌های حاوی محیط نیمه‌جامد فاقد ازت انتقال و در درجه حرارت 30 درجه سانتی‌گراد درون انکوباتور قرار داده شدند. اجزای این محیط عبارتند از: ‌مالیک اسید 5 گرم، فسفات هیدروژن دی پتاسیم 5/0گرم، سولفات منیزیم 2/0 گرم، کلرید سدیم 1/0 گرم، کلرید کلسیم 02/0 گرم، محلول عناصر کمیاب 2 میلی‌لیتر، محلول الکلی بروموتیمول‌بلو 2 میلی‌لیتر (5 درصد)، اتیلن دی آمین تترا استات 4 میلی‌لیتر، محلول ویتامین 1 میلی‌لیتر، هیدروکسید پتاسیم 4 گرم، آگار 75/1 گرم و آب مقطر 1000 میلی‌لیتر (محلول سود برای تنظیم اسیدیته تا 8/6). اجزای محلول عناصر کمیاب عبارتند از: مولیبدات سدیم 2/0 گرم، سولفات منگنز 235/0گرم، بوریک اسید 28/0گرم، سولفات مس 008/0گرم، سولفات روی 024/0 گرم و آب مقطر 200 میلی‌لیتر.
محلول ویتامین شامل: بیوتین 01/0 گرم، پیرودوکسین 02/0 گرم و آب مقطر 100 میلی‌لیتر است. پس از گذشت 3 تا 5 روز که دیسک رشد (پلیکل) نزدیک به سطح محیط‌کشت تشکیل شد، این باکتری‌ها به محیط جامد NFb منتقل شدند. هنگامی که برخی باکتری‌های اندوفیت تثبیت‌کننده ازت در محیط نیمه‌جامد تکثیر شوند، یک دیسک رشدی تشکیل می‌گردد که با گذشت زمان ممکن است تا نزدیک سطح محیط مهاجرت نماید و در اصطلاح به آن « دیسک رشد » گفته می‌شود. پس از رشد در سطح محیط‌ جامد NFb، باکتری‌ها دوباره به محیط نیمه‌جامد NFb منتقل شده، در صورت تشکیل مجدد دیسک رشد، این نتیجه حاصل می‌شود که باکتری‌های جداسازی شده تثبیت‌کننده ازت هستند (Martin-Didonet et al., 2000).

تکثیر ژن 16S rDNA با استفاده از PCR
پس از جداسازی باکتری‌ها، به منظور شناسایی و تأیید نهایی جدایه‌ها، روش PCR ژن 16S rDNA به کار گرفته شد. استخراج DNA در جدایه‌های Pseudoxanthomonas، Stenotrophomonas و Azospirillum به روش استات سدیم انجام شد. در این روش سلول باکتری با استفاده از بافر لیز کننده (شامل EDTA، لیزوزیم، SDS، پروتئیناز K) شکسته شده و پروتئین‌های آن تغییر ماهیت داده، سپس با استفاده از فنل و کلروفرم تمام اجزا به غیر از اسیدهای نوکلئیک رسوب داده می‌شود و در پایان، با استفاده از استات سدیم و اتانول، DNA موجود در محلول را رسوب می‌دهند (Maciel et al., 2009).
به منظور تکثیر ژن 16S rDNA با استفاده از PCR، از پرایمر رفت (نوکلئوتید 37 تا 64 از 16S rDNA Azospirillum) و پرایمر برگشت (نوکلئوتید 407 تا 436 از 16S rDNA Azospirillum) با توالی زیر استفاده شد:

PFAZO: 5'-AGA GGG GCC CGC GTC CGA TTA GGT AGT T-3'

PRAZO: 5'-CCC GAC AGT ATC AAA TGC AGT TCC CAG GTT-3'

طراحی پرایمرها برای منطقه 16S rDNA با استفاده از ژن بانک http://www.ncbi.nem.nih.gov انجام شد. طول محصول PCR‌ 400 جفت ‌باز بود.
همچنین برای یکی از جدایه‌ها (StR1) نیز از پرایمرهای عمومی 16S rDNA به نام‌های 27F و 1492R استفاده شد. طول محصول PCR‌ 1500 جفت ‌باز است و به عبارتی، با استفاده از این پرایمرها کل طول 16S rRNA طی PCR سنتز می‌شود. توالی آنها عبارتند از:

PF (27F):
5´-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3´
PR (1492R):
5´-GGCTTACCTTGTTACGACTT-3´

هر 25 میکرولیتر محلول واکنش PCR شامل پرایمرها هر کدام 2 میکرولیتر (10 میکرومولار)، DNA الگو 2 میکرولیتر، dNTPs dATP)، dCTP، dGTP و (dTTP 5/0 میکرولیتر (10 میلی‌مولار)، Taq DNA Pol 5/0 میکرولیتر (25/0 واحد) (از ژن فن‌آوران، ایران)، بافر PCR 10X 5/2 میکرولیتر، کلرید منیزیم 5/0 میکرولیتر (50 میلی‌مولار) و آب مقطر استریل 15 میکرولیتر بود. مراحل PCR با استفاده از پرایمرهای 16S rDNA Azospirillum در دستگاه ترموسایکلر (Bio Rad, USA) انجام شد. برنامه شامل واسرشت ‌شدن اولیه در 95 درجه سانتیگراد به مدت 4 دقیقه، 30 سیکل شامل 94 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، 55 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه و یک سیکل نهایی سنتز 72 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه بود. مراحل PCR با استفاده از پرایمرهای عمومی 16S rDNA شامل واسرشت‌ شدن اولیه در 93 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 35 سیکل شامل 93 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، 55 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 5/1 دقیقه و یک سیکل نهایی سنتز شامل 72 درجه سانتیگراد به مدت 7 دقیقه بود.

تعیین توالی محصول PCR ژن 16S rDNA و ترسیم درخت فیلوژنتیک
با توجه به الگوی کل پروتئین سلول جدایه‌ها و مشابهت برخی جدایه‌ها با یکدیگر، توالی‌های bp 400 مربوط به جدایه‌های PxR1، StR1، PxW2 و PxW3 برای توالی‌یابی انتخاب شدند. همچنین، باند bp 1500 مربوط به 16S rRNA جدایه StR1 نیز انتخاب شد. توالی‌ها با استفاده از یک DNA sequencer (Sanger et al., 1977) به صورت خودکار (SEQLAB, Germany) و بر اساس روش اتمام زنجیره (روش Sanger) و به سفارش شرکت فزاپژوه (Faza Biotech) تعیین توالی شدند. برای ترسیم درخت فیلوژنتیک بر اساس توالی 16S rRNA از روش اتصال مجاور (neighbour-joining) (Saitou and Nei, 1987) و نرم‌افزار MEGA نسخه 4 استفاده شد.

طیف‌سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه
برای انجام آزمایش، جدایه‌ها ابتدا در سطح محیط نوترینت آگار کشت داده شدند و سپس کلونی‌ها از سطح محیط با آب مقطر استریل شستشو و سپس در rpm 10000 به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ شدند. محلول رویی جدا و رسوب باکتری 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شد. مقدار بسیار کم در حد 20 میلی‌گرم از رسوب باکتری برداشته و روی دیسک کریستالی سلنید روی (Spectra-Tech ARK ATR cell) قرار داده شد و دیسک‌ها به مدت یک ساعت در دمای 45 درجه سانتیگراد خشک شدند و در نهایت، دیسک‌ها به دستگاه انتقال یافتند (Nicolet 6700 FT-IR Spectrometer) و پس از مدت کوتاهی طیف حاصل از پیوندهای شیمیایی موجود در سطوح باکتری اسکن و طیف حاصله روی مانیتور رایانه آشکار شده، با مقایسه با جدول استاندارد مربوط به انواع پیوندها و گروه‌های عاملی، تشابه و تفاوت بین طیف‌ها در بین باکتری‌ها تفسیر شد. در ضمن، با مقایسه طیف باکتری‌های مجهول نسبت به سویه‌های استاندارد، سویه‌های جداسازی شده شناسایی شدند (Erukhimovitch et al., 2005). در این مطالعه، برای نخستین بار در ایران از این روش برای شناسایی باکتری‌ها استفاده شده است.

نتایج
این مطالعه نخستین گزارش از تشکیل دیسک رشد در محیط NFb به وسیله Pseudoxanthomonas و Stenotrophomonas است. این باکتری‌ها دیسک رشد نزدیک به سطح تا عمقی تشکیل می‌دهند. توانایی رشد و تشکیل دیسک رشد توسط این باکتری‌ها دال بر توانایی تثبیت ازت، آن هم در شرایط میکروآئروفیلیک یا بی‌هوازی است. سویه‌های استاندارد Azospirillum نیز تقریباً دارای الگوی دیسک رشدی مشابه هستند. این باکتری‌ها مشابه Azospirillum‌ها در محیط NFb جامد، کلونی‌های قطره آبی تشکیل می‌دهند.
با توجه به مشابهت جدایه‌های PxR2 و StR1 به یکدیگر و همچنین، جدایه‌های PxW1 و PxW2 با هم (بر اساس آزمون نیم‌رخ کل پروتئین‌های داخل سلول که داده‌ها نشان داده نشده) و با توجه به مشخص بودن جدایه‌های S1 و S2، محصول PCR ژن 16S rDNA مربوط به جدایه‌های PxR1، StR1، PxW2 و PxW3 جهت توالی‌یابی به شرکت فزاپژوه ارسال شدند. وقتی خود پرایمرهای اختصاصی Azospirillum با استفاده از سایت ncbi تطبیق و بلاست می‌شود، فقط با توالی
16S rRNA جنس Azospirillum و به ویژه گونه Brasilense مشابهت داشته، جنس‌های باکتریایی دیگر را شناسایی نمی‌کند، اما وقتی توالی‌های bp 400 مربوط به چهار جدایه که با پرایمرهای ذکر شده PCR شده، تطبیق و بلاست می‌شوند، هر چهار جدایه گونه جدیدی از جنس باکتریایی Pseudoxanthomonas و با حداکثر تشابه 95 درصد را نشان می‌دهند. وقتی توالی 16S rRNA یکی از آن چهار جدایه به نام جدایه StR1 که با پرایمر عمومی PCR شده، بلاست می‌شود، مشابهت 95 درصدی این باکتری را با جنس Stenotrophomonas نشان می‌دهد (شکل 1). توجه به این نکته، ضروری است که دو جنس Pseudoxanthomonas و Stenotrophomonas جزو یک خانواده بوده، به خانواده Xanthomonadaceae تعلق دارند.


شکل 1- درخت فیلوژنتیک بر اساس توالی 16S rRNA بین جنس Pseudoxanthomonas و برخی از جنس‌های دیگر

 



در ارتباط با FTIR جدایه‌ها (شکل 2)، در تمام سویه‌ها و جدایه‌ها پیوند N-H که به گروه‌های آمین و آمید موجود در پروتئین‌ها مربوط است، وجود دارد. همچنین، باند جذبی مربوط به هالوژن‌ها در جدایه‌های S2، PxW1، PxW2 و سویه‌های استاندارد Azospirillum نیز متفاوت از یکدیگر و همچنین، با سایر جدایه‌ها متفاوتند. هر چند جدایه StR1 در برخی پیک‌ها، به ویژه پیک‌های جذبی بالا مشابه جدایه‌های PxR2، PxW2 و PxW3 است، اما شدت جذب و به عبارتی، مقدار غلظت باند در جدایه StR1 بیشتر است.

 

شکل 2- طیف‌های FTIR در نواحی cm-1 400-4000 از سویه‌های استاندارد Azospirillum و جدایه‌های اندوفیت برنج PxR2) و (StR1 و گندم PxW2) و (PxW3


بحث و نتیجه‌گیری
بسیاری از گونه‌های جنس Pseudoxanthomonas از فیلترهای زیستی و لجن، از هضم‌کننده‌های بی‌هوازی، خاک‌های هوادهی شده، خاک‌های آلوده به هیدروکربن‌های چندحلقه‌ای یا روغن‌ها و همچنین از چشمه‌های آب داغ جداسازی می‌شوند (Young et al., 2007). Manter و همکاران (2010) توانستند Pseudoxanthomonas را به صورت اندوفیت از گیاه سیب‌زمینی جداسازی کنند.
Stenotrophomonas نیز در ریزوسفر بسیاری از گیاهان وجود دارد (Hayward et al., 2009). اعضای جنس Stenotrophomonas اهمیت اکولوژیک در خور توجهی در چرخه‌های ازت و گوگرد دارند و چندین گونه از این جنس، مانند Stenotrophomonas malthophilia و S. rhizophilia می‌توانند در برهمکنش مفید با گیاهان نقش داشته باشند
(Ryan et al., 2009). گونه‌های Stenotrophomonas maltophilia و Stenotrophomonas rhizophila اغلب در ارتباط با گیاهان یافت می‌شوند. این باکتری‌ها می‌توانند از ریزوسفر و یا از بافت‌های داخلی گیاه، به ویژه از بافت‌های آوندی ریشه و ساقه جداسازی شوند. سویه‌های اندوفیت Stenotrophomonas maltophilia از ریشه بسیاری از گونه‌های گیاهی شامل برنج و سایر گیاهان جدا شده‌اند (Ryan et al., 2009).
در مطالعه Sun و همکاران (2008)، تنوع باکتری‌های اندوفیت برنج با استفاده از روش‌هایی نظیر آنالیز 16S rRNA به کمک پرایمرهای عمومی 16S rRNA باکتری‌ها به نام 799F و 1492R بررسی و 192 جدایه شناسایی شدند که شامل تمام زیررده‌های آلفا، بتا، گاما، دلتا و اپسیلون پروتئوباکتری‌ها بودند. گروه غالب بتا پروتئوباکتری‌ها (8/27 درصد از کل کلون‌ها) بوده، فراوان‌ترین جنس نیز از Stenotrophomonas (گونه malthophilia) بود.
باکتری‌های جنس Azospirillum نیز متعلق به خانواده Spirillaceae، زیررده آلفاپروتئوباکتری‌ها هستند. آنها به صورت آزاد در خاک و یا متصل به ریشه‌ها، ساقه‌ها، برگ‌ها و بذور به ویژه در غلات و گیاهان علفی یافت می‌شوند، هر چند در گیاهانی نظیر نارگیل، سبزیجات، میوه‌ها، لگوم و گیاهان غده‌ای نیز یافت شده‌اند. اگرچه آنها حالت اپی‌فیت داشته، در نزدیکی یا سطح ریشه وجود دارند، ولی می‌توانند به درون ریشه به حالت اندوفیت نیز نفوذ کنند. بسیاری از Azospirillum‌ها دارای میزبان اختصاصی از گیاهان علفی و غلات هستند (Doebereiner et al., 1995).
در این مطالعه باکتری‌هایی که به صورت اندوفیت از ریشه‌های برنج و گندم جداسازی شده‌اند متعلق به جنس‌های Pseudoxanthomonas و Stenotrophomonas بودند. در آزمون‌های قبلی به نظر رسید که از سه جدایه برنج دو جدایه PxR2، StR1 شبیه هم هستند. همان‌‌طور که در مقدمه توضیح داده شد، از روش FTIR برای شناسایی باکتری‌ها در حد جنس و گونه استفاده شده و در ایران نیز برای نخستین بار از این روش استفاده شده است. آنالیز FTIR، شباهت کاملی را بین جدایه‌های برنج و گندم و با Azospirillum تأیید نکرد. با مقایسه کلیه روش‌های فوق تأیید می‌شود که جدایه‌های گندم به یکدیگر شبیه هستند. توالی‌یابی توالی bp 400 حاصل از پرایمرهای عمومی، باکتری StR1 را با شباهت 95 درصد گونه جدید از Stenotrophomonas معرفی کرد. برای نخستین بار در این مطالعه نشان داده شد که Pseudoxanthomonas به صورت اندوفیت در ریشه برنج وجود دارد.

 

Doebereiner, J., Baldani, V. and Reis, V. M. (1995) Endophytic occurrence of diazotrophic bacteria in non-leguminous crops. In: Azospirillum VI and related microorganisms (eds. Del Gallo, M., Vanderleyden, J. and De Zamaroczy, M). 3-14. Springer Verlag, Berlin.

Erukhimovitch, V., Pavlov, V., Talyshinsky, M., Souprun, Y. and Huleihel, M. (2005) FTIR microscopy as a method for identification of bacterial and fungal infections. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 37: 1105-1108.

Goodacre, R., Timmins, E. M., Burton, R., Kaderbhai, N., Woodward, A. M., Kell, D. B. and Rooney, P. J. (1998) Rapid identification of urinary tract infection bacteria using hyperspectral whole-organism fingerprinting and artificial neural networks. Microbiology 144: 1157-1170.

Hayward, A. C., Fegan, N., Fegan, M. and Stirling, G. R. (2009) Stenotrophomonas and Lysobacter: ubiquitous plant-associated gamma-proteobacteria of developing significance in applied microbiology. Journal of Applied Microbiology 108: 756-770.

Kummerle, M., Scherer, S. and Seiler, H. (1998) Rapid and reliable identification of fermentative yeasts by Fourier-transform infrared spectroscopy. Applied and Environmental Microbiology 64: 2207-2214.

Maciel, B. M., Santos, A. C. F., Dias, J. C. T., Vidal, R. O., Dias, R. G. C., Gross, E., Cascardo, J. C. M. and Rezende, R. P. (2009) Simple DNA extraction protocol for a 16S rDNA study of bacterial diversity in tropical landfarm soil used for bioremediation of oil waste. Genetic and Molecular Research 8: 375-388.

Manter, D. K., Delgado, G. A., Holm, D. G. and Stong, R. A. (2010) Pyrosequencing reveals a highly diverse and cultivar-specific bacterial endophyte community in potato roots. Microbial Ecology 60: 157-166.

Martin-Didonet, C. C. G., Chubatsu, L. S., Souza, E. M., Kleina, M., Rego, F. G. M., Rigo, L. U., Yates, M. G. and Pedrosa, F. O. (2000) Genome structure of the genus Azospirillum. Journal of Bacteriology 182: 4113-4116.

Naumann, D., Helm, D. and Schultz, C. (1994) Characterization and identification of microorganisms by FT-IR spectroscopy and FT-IR microscopy. In: Bacterial diversity and systematics (eds. Priest, F. G., Ramos Cormenzana, A. and Tindall, B. J.) 67-85. Springer, New York.

Ryan, R. P., Monchy, S., Cardinale, M., Taghavi, S., Crossman, L., Avison, M. B., Berg, G., Lelie, D. and Dow, J. M. (2009) The versatility and adaptation of bacteria from the genus Stenotrophomonas. Nature Review 7: 514-525.

Saitou, N. and Nei, M. (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4: 406-425.

Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74: 5463-5467.

Sun, L., Qiu, F., Zhang, X., Dai, X., Dong, X. and Song, W. (2008) Endophytic bacterial diversity in rice (Oryza sativa L.) roots estimated by 16S rDNA sequence analysis. Microbial Ecology 55: 415-424.

Tindall, B. J., Brambilla, E., Steffen, M., Neumann, R., Pukall, R., Kroppenstedt, R. M. and Stackebrandt, E. (2000) Cultivatable microbial diversity: gnawing at the Gordian knot. Environmental Microbiology 2: 310-318.

Young, C. C., Ho, M. J., Arun, A. B., Chen, W. M., Lai, W. A., Shen, F. T., Rekha, P. D. and Yassin, A. F. (2007) Pseudoxanthomonas spadix sp. nov., isolated from oil-contaminated soil. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57: 1823-1827.

Young, C. C., Hupfer, H., Siering, C., Ho, M. J., Arun, A. B., Lai, W. A., Rekha, P. D., Shen, F. T., Hung, M. H., Chen, W. M. and Yassin, A. F. (2008) Azospirillum rugosum sp. nov., isolated from oil-contaminated soil. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 58: 959-963.