شواهدی از انتخاب متعادل چند شکلی‌های PAH-BglII و PAH-EcoRI در جمعیت اصفهان

نویسندگان

1 کارشناس ارشد ژنتیک، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

2 دانشیار ژنتیک، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

چکیده

دو مارکر چندشکلی BglII و EcoRI در اینترون 1 و اینترون 5 ژن فنیل آلانین هیدرکسیلاز (Phenylalanine Hydroxylase, PAH)| شناخته شدند. برای آزمودن اینکه آیا این چندشکلی‌ها به مانند آلل‌های خنثی عمل می‌کنند یا در معرض فشار انتخاب در جمعیت اصفهان قرار دارند، 110 فرد با روش PCR-RFLP تعیین ژنوتیپ گردیدند. فایل ورودی Arlequin با استفاده از اطلاعات هاپلوتیپی با فاز شناخته شده آماده شد و آزمون‌های Neutrality (آزمون D تاجیما و آزمون Fu’s Fs) با استفاده از برنامه Arlequin انجام شد. 42 فرد در هر دو چندشکلی هتروزیگوت بودند و فاز هاپلوتیپی آن‌ها ناشناخته باقی ماند. فاز هاپلوتیپی BglII-EcoRI فقط در 68 فرد شناخته شد که برای آماده سازی فایل ورودی استفاده گردید. مقدار D تاجیما و مقدار Fs در جمعیت اصفهان به ترتیب 7/1 و 02/1 است. مقدار مثبت Fs وD>0 بیانگر آن است که این چندشکلی‌ها در جمعیت اصفهان تحت انتخاب متعادل هستند. اگرچه این چندشکلی‌ها در ناحیه غیرکدکننده ژن PAH قرار دارند، ولی آن‌ها آلل‌های خنثی نیستند و مقدار مثبت این آزمون‌ها، شواهدی برای انتخاب متعادل این چندشکلی‌ها در جمعیت اصفهان فراهم می‌سازند. نتایج این مطالعه می‌تواند درک ما را از تاریخ تکاملی و ساختار جمعیت اصفهان بهبود بخشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evidences for balancing selection from PAH-BglII and PAH-EcoRI polymorphisms in Isfahan population

نویسندگان [English]

  • Zahra Fazeli Attar 1
  • Sadeq Vallian Borojeni 2
1 Department of Biology, Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, Iran
2 Department of Biology, Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Two polymorphic markers including BglII and EcoRI, were identified at intron 1 and intron 5 of PAH gene. In order to test whether these polymorphisms are behaving as neutral alleles or are being subjected to selective pressures in Isfahan population, 110 individuals were genotyped by PCR-RFLP. The Arlequin input file was prepared by use of phase-known haplotype data and Neutrality tests (Tajima D test and Fu’s Fs test) were done using Arlequin program. 42 individuals were found heterozygous for both polymorphisms whose haplotype phase remained unknown. The BglII-EcoRI haplotype phase was known only at 68 individuals who were used for preparation of input file. Tajima's D value and Fs value at Isfahan population were 1.7 and 1.02, respectively. Positive values of Fs and D>0 indicated that these polymorphisms are under selection pressure at Isfahan population. Although these polymorphisms were in the non-coding region of PAH gene, but these were not neutral alleles and positive values of these tests provided evidence for balancing selection of these polymorphisms at Isfahan population. The results of this study could improve our understanding of evolutionary history and structure of Isfahan population.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Neutrality test
  • Arlequin program
  • DNA polymorphism
  • PAH gene

مقدمه

مطابق با تئوری مولکولی تکامل خنثی، اکثر چندشکلی‌های DNA از لحاظ انتخاب خنثی هستند و تغییر در فراوانی آللی این لوکوس‌ها به دلیل رانش ژنتیکی تصادفی و به ندرت به دلیل انتخاب است. امروزه آزمون‌های Neutrality متعددی توسعه یافته است که با استفاده از آن‌ها می‌توان جایگزینی‌های نوکلئوتیدی را که به مانند آلل‌های خنثی عمل می‌کنند و یا در معرض فشار انتخاب در یک جمعیت قرار دارند بررسی کرد. یکی از آزمون‌های Neutralityکه برای بررسی اثر فشار انتخاب بر روی یک ژن به کار برده می‌‌شود، D تاجیما(Tajima’ D)| است. این آزمون بر اساس مقایسه تنوع نوکلئوتیدی حاصل از تعداد و تنوع نوکلئوتیدی حاصل از فراوانی اللی جایگاه‌های چند شکلی است
(Carlson et al.,2005; Tajima,1989). با استفاده از آزمونD تاجیما و سایر آزمون‌های Neutrality، مانند آزمون‌های Fu’s Fs و Wu's H، که برای آزمون تئوری خنثی به کار برده می‌‌شوند، مشخص شده است که طیف فراوانی جایگاه چندشکلی ژن‌های گروه خونی ABO (Seltsam et al., 2003)، HLA (Hughes and (Yeager, 1998، لاکتاز (Bersaglieri et al., 2004) و TRPV6 (Akey et al., 2004; Stajich and (Hahn, 2005 با تئوری خنثی سازگار نیستند.ژن‌هایی که تنوع فراوانی آللی آن‌ها بالاست (همانند آنچه در مورد ژن‌های ABO و HLA مشاهده شده است) D تاجیما مثبت دارند و با انتخاب متعادل در جمعیت همراه هستند، در حالی که، ژن‌هایی که تنوع فراوانی آللی آن‌ها پایین است (مانند لاکتاز و TRPV6) D تاجیمای منفی دارند و با فشار انتخابی همراه هستند که یک واریانت سودمند را در جمعیت جایگزین سایر واریانت‌ها کرده است. ژن‌هایی که به تازگی در معرض انتخاب قرار گرفته اند و آلل سودمند هنوز آلل اصلی در جمعیت نشده است، برای مثال ژن Duffy (Hamblin and Di Rienzo, (2000, Hamblin et al., 2002 و ژن CCR5 (Claustres et al., 1998) به سادگی با استفاده از آزمون D تاجیما قابل مطالعه نیستند، در حالی که آن‌ها را می‌‌توان با استفاده از آزمون Wu's بررسی کرد.

از جمله آزمون‌های Neutrality دیگری که برای مطالعه تأثیر انتخاب بر روی یک ژن به کار برده می‌‌شود، آزمون Ewens-Watterson (آزمون E-W) است. با استفاده از آزمون E-W می‌‌توان بررسی کرد که اثر انتخاب بر روی یک ژن در جمعیت جهت‌دار یا متعادل است (Watterson, 1978).

ژن فنیل آلانین هیدرکسیلاز (Phenylalanine Hydroxylase, PAH)|، آنزیم فنیل‌آلانین 4- مونوهیدروکسیلاز را کد می‌‌کند که تبدیل غیر قابل‌برگشت فنیل‌آلانین به تیروزین را بر عهده دارد. این آنزیم به طور طبیعی در کبد بیان می‌شود که بیان آن با مقدار کمتری در کلیه هم مشاهده شده است. از آن جهت که هیدروکسیلاسیون فنیل‌آلانین، مرحله محدودکننده سرعت در کاتابولیسم فنیل‌آلانین است، کمبود آنزیم فنیل آلانین هیدروکسیلاز باعث بروز فنوتیپ PKU می‌گردد
(Kwok et al. and 1985; Madden, 2004). از جمله چندشکلی‌هایی که در ناحیه ژن PAH شناسایی شده است، مارکرهای چندشکلی با طول قطعات محدودکننده (RFLP) است. مارکرهای پلی مورف موجود در ناحیه ژنی با توجه به پیوستگی کاملی که با ژن PAH دارند، دارای کاربرد فراوانی در تحلیل پیوستگی ژن با جهش‌های ژنی هستند (Fazeli and Vallian, 2009). از جمله کاربرد آن‌ها می‌توان به شناسایی ناقلان بیماری در خانواده‌های افراد بیمار اشاره نمود (Dworniczak et al., (1991.

با توجه به تفاوت فراوانی آللی و درجه هتروزیگوتی پلی‌مورف در جمعیت‌های مختلف، ضروری است قبل از به کارگیری مارکرهای مزبور، وضعیت آن‌ها در جمعیت مورد مطالعه، مورد بررسی دقیق جمعیت‌شناختی قرار گیرد. در این مطالعه، دو مارکر چندشکلیBglII و EcoRI که به ترتیب در اینترون 1 و اینترون 5 ژنPAH  قرار دارند (شکل 1) برای مطالعه آزمون Neutrality در جمعیت اصفهان انتخاب شدند. نتایج این مطالعه می‌تواند درک ما را از اثر فشار انتخاب بر روی ژن PAH در جمعیت اصفهان افزایش دهد.

 

شکل 1- جایگاه مارکرهای چندشکلیBglII  و EcoRIکه به ترتیب در اینترون 1 و اینترون 5 ژنPAH قرار دارند. ژن PAHدارای 13 اگزون است. اگزون‌ها در ژن PAHبا اعداد 13-1 مشخص شدند.

 


مواد و روش‌ها

تهیه نمونه

در این مطالعه، نمونه خون از 110 فرد غیرخویشاوند از جمعیت اصفهان گرفته شد که زیرمجموعه‌ای از جمعیت اصفهان‌ هستند. بنابراین، نتایج به دست آمده را می‌توان به تمام جمعیت اصفهان نسبت داد.

استخراج DNA ژنومی و انجامPCR

از نمونه‌های خونی تهیه شده، DNA ژنومی با روش اصلاح شده استاندارد رسوب نمک استخراج شد (Miller et al., 1988). پس از آن، ناحیه مربوط به دو مارکر ژن PAH،PAH-BglII  و PAH-EcoRI، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر شد  (Dworniczak et al., 1991; Kidd, 2002). واکنش PCR در حجم 25 میکرولیتر شامل 50 نانوگرم DNA ژنومی، 10 پیکو مول از هر پرایمر، 5/2 واحد آنزیم Taq پلیمراز و مخلوط dNTP در غلظت نهایی 10 میلی مولار، در بافر 10X همراه PCR و MgCl2 انجام شد. پس از آن ژنوتیپ محصولات PCR بر روی ژل آگاروز 5/1% تعیین شد.

هضم آنزیمی محصول PCR

پس از انجام PCR، به منظور تعیین حضور یا عدم­حضور جایگاه شکست آنزیم­های BglII و EcoRI، هضم آنزیمی بر روی محصولات تکثیر جایگاه‌هایBglII و EcoRI انجام شد. هضم آنزیمی محصول PCR با هر کدام از این آنزیم‌ها بدین صورت انجام شد که به یک ویال 10 میکروگرم از نمونه DNA محصول PCR به همراه 5 واحد از آنزیم (5/0 میکرولیتر از آنزیم) و 5/2 میکرولیتر بافر اضافه گردید و با آب دو بار تقطیر به حجم 25 میکرولیتر رسانده شد. ویال حاوی مخلوط واکنش هضم آنزیمی به مدت یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد در بن ماری قرار داده شد تا هضم آنزیمی کامل گردد. محصولات هضم آنزیمی توسط الکتروفورز با ژل 5/1 درصد آگاروز بررسی گردید  (Fazeli and Vallian, 2009).

آنالیزهای آماری

اطلاعات اولیه­ای که برنامه Arlequin برای تخمین آزمون Neutrality استفاده­ می‌کند، باید از نوع توالی DNA یا اطلاعات مربوط به مارکرهای  RFLPبا فاز گامتی شناخته شده باشند (Schneider et al., 2000). در این مطالعه، از اطلاعات هاپلوتیپی با فاز گامتی شناخته شده دو مارکر RFLP برای تخمین آزمون­های Neutrality (آزمون­های D تاجیما و Fu’s Fs و آزمون  E-W) در جمعیت اصفهان استفاده گردید. همچنین با استفاده از همین برنامه، هتروزیگوسیتی مورد انتظار و هتروزیگوسیتی مشاهده شده این دو مارکر در جمعیت اصفهان تخمین زده شد.

 

مشاهدات

امروزه به منظور بررسی اثر فشار انتخاب بر روی یک ژن در جمعیت از آزمون‌های Neutrality استفاده می­گردد. در این مطالعه از اطلاعات هاپلوتیپی BglII-EcoRI در ژن PAH برای تخمینD  تاجیما، Fs و اجرای آزمون E-W (آزمون­های Neutrality ) استفاده گردید. مارکرهای BglII و EcoRI به ترتیب در اینترون 1 و اینترون 5 ژنPAH قرار دارند (شکل 1). تخمین فاز هاپلوتیپی با استفاده از تعیین ژنوتیپ دو مارکر BglII و EcoRI در 110 فرد غیر خویشاوند انجام گرفت. تکثیر ناحیه مربوط به مارکر BglII و EcoRI به ترتیب قطعه­ای با طول 290 و 458 جفت بازی تولید کرد که در صورت حضور جایگاه شکست آنزیم  BglIIو EcoRI به ترتیب به قطعاتی با طول 209 و 81 جفت بازی و طول 412 و 46  جفت بازی شکسته شدند (شکل 2).

فاز گامتی هاپلوتیپ BglII-EcoRI مشاهده شده در 110 فرد مورد مطالعه در جمعیت اصفهان در جدول 1 نشان داده شده است. برای هر هاپلوتیپ اعداد از چپ به راست به ترتیب نشان­دهنده آلل BglII، EcoRI  در ژن PAH است. برای مارکرهای BglII و  EcoRIاعداد 1 و 0 به ترتیب حضور (+) و عدم­حضور(-) جایگاه شکست آنزیم محدود­کننده را مشخص می‌کند. در اطلاعات ژنوتیپی، اعداد 0، 1 و 2 به ترتیب برابر با ژنوتیپ­های -/-، +/+ و +/- است. با استفاده از اطلاعات ژنوتیپی، تنها فازگامتی هاپلوتیپ  BglII-EcoRIدر 68 فرد تعیین گردید. ژنوتیپ 42 فرد مورد مطالعه در هر دو مارکر  BglII و EcoRI هتروزیگوت بود. بنابراین، فاز هاپلوتیپی در این افراد ناشناخته باقی ماند.

 


 

شکل 2- بررسی وضعیت ژنوتیپی مارکرهای Eco RI و Bgl IIدر جمعیت اصفهان

تعیین ژنوتیپ(A مارکر IIBgl ، (BEcoRI.به منظور بررسی وضعیت ژنوتیپی مارکرهای مزبور DNA ژنومی با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر شده و سپس توسط آنزیم‌های محدود کننده مورد هضم قرار گرفته است. چنانکه در شکل نشان داده شده است، اطلاعات ژنوتیپی برای افراد هموزیگوت منفی، هموزیگوت مثبت و هتروزیگوت به ترتیب به صورت -/-، +/+ و +/- نشان داده شده‌اند. M نشان‌دهنده مارکر اندازه است. برای اطلاعات بیشتر به متن رجوع شود.

 

جدول 1- فازهای گامتی هاپلوتیپ BglII-EcoRIمشاهده شده در 110 فرد مورد مطالعه جمعیت اصفهان

 

فراوانی (تعداد افراد)

فازهای گامتی هاپلوتیپ

اطلاعات ژنوتیپی

5

11

10

12

 

42

01

00

02

 

12

11

01

21

 

1

10

10

10

 

2

10

00

20

 

2

00

00

00

 

4

01

01

01

 

42

نامشخص

22

 

         

 

 

اطلاعات هاپلوتیپی 68 فرد که فاز گامتی آن­ها مشخص بود، برای تهیه فایل ورودی برنامه Arlequin استفاده گردید و مقدار D تاجیما و Fu’s Fs در جمعیت اصفهان به ترتیب برابر با 7/1 و 02/1 تخمین زده شد. مقدار F موردانتظار و مشاهده شده در آزمون E-W برابر با 35/0 و 59/0 تخمین زده شد. برای تخمین هتروزیگوسیتی مشاهده شده و هتروزیگوسیتی مورد انتظار این دو مارکر در جمعیت اصفهان از اطلاعات ژنوتیپی110 فرد استفاده گردید. میزان هتروزیگوسیتی موردانتظار و هتروزیگوسیتی مشاهده شده دو مارکر BglII و EcoRI در جمعیت اصفهان که با استفاده از برنامه Arlequin تخمین زده شد، در جدول 2 نشان داده شده است.


 

جدول 2: درجه هتروزیگوسیتی چندشکلی­های BglII و EcoRI در ژن PAH در جمعیت اصفهان

چندشکلی

هتروزیگوسیتی مورد انتظار

هموزیگوسیتی مورد انتظار

هتروزیگوسیتی مشاهده شده

هموزیگوسیتی مشاهده شده

PAH-BglII

43%

57%

51%

49%

PAH-EcoRI

50%

50%

81%

19%

 

 


نتیجه‌گیری و بحث

در این مطالعه، از اطلاعات هاپلوتیپی BglII-EcoRI در ژن PAH برای بررسی اثر انتخاب بر روی این ژن در جمعیت اصفهان استفاده گردید. اگر چه هر دو این چندشکلی­ها درناحیه غیرکدکننده ژن PAH قرار دارند و به نظر می­رسد که تئوری خنثی در مورد آن­ها صدق می کند، ولی تخمین مقدار D تاجیما و Fu’s Fs نشان می­دهد که این چندشکلی­ها در جمعیت اصفهان از نظر انتخاب خنثی نیستند. مقدار مثبت هر دو آزمون بیانگر آن است که این چندشکلی‌ها در جمعیت اصفهان تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارند یا به تازگی تحت تأثیر مانع جمعیتی قرار گرفته‌اند.

موانع جمعیتی، فرآیندهای تکاملی هستند که مانع تولیدمثل درصد بالایی از جمعیت می­گردند. موانع جمعیتی می‌تواند باعث افزایش درون­زادآوری یا اثر بنیانگذار گردد (Pasternak, 2005) که معمولا باعث کاهش هتروزیگوسیتی می­گردند. در جمعیت مورد مطالعه، هتروزیگوسیتی مشاهده شده چندشکلی BglII تقریبا با هموزیگوسیتی مشاهده شده برابر است و هیچ کاهشی در هتروزیگوسیتی نسبت به هموزیگوسیتی مشاهده ­نمی‌شود. در مورد چندشکلی EcoRI، هتروزیگوسیتی در جمعیت اصفهان فراوانی بالاتری نسبت به هموزیگوسیتی دارد، بنابراین، به نظر نمی­رسد که مانع جمعیتی نقش مهمی را در مثبت بودن مقدار آزمون D تاجیما و Fu’s Fs در جمعیت اصفهان داشته باشد.

انتخاب متعادل مربوط به فرآیندهای انتخابی است که چندین آلل مختلف یک ژن در استخر ژنی یک جمعیت در فراوانی بالا حفظ می­گردد. در این شرایط، معمولا هتروزیگوت­ها سازگاری زیستی و تولید مثلی بالاتری نسبت به هموزیگوت­ها را دارا هستند  .(Schneider et (al., 2000 همانطور که در جدول 2 مشاهده می‌شود، هتروزیگوسیتی مشاهده شده چندشکلی EcoRI در ژن PAH در جمعیت اصفهان بسیار بالاتر از هتروزیگوسیتی مورد انتظار این مارکر است که شاهدی بر انتخاب متعادل بر روی چندشکلی EcoRI در ژن PAH در جمعیت اصفهان است. با وجود اینکه چندشکلی  EcoRIدر اینترون 5 ژن PAH (ناحیه غیرکدکننده) قرار دارد، ولی به نظر می­رسد که افراد هتروزیگوت در چندشکلی EcoRI سازگاری زیستی بالاتری نسبت به افراد هموزیگوت دارند. در واقع، نتایج حاصل از آزمون­های Neutrality به همراه مقایسه نتایج حاصل از تخمین هتروزیگوسیتی مورد انتظار و هتروزیگوسیتی مشاهده شده، مؤید آن است که چندشکلی EcoRI در جمعیت اصفهان تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارد.

آزمون دیگری که به طور گسترده در ژنتیک جمعیت به منظور تخمین اثر انتخاب بر روی یک ژن به کار برده می‌شود، آزمون E-W است. در این آزمون، مجموع هموزیگوسیتی مشاهده شده برای هر هاپلوتیپ در یک لوکوس (Fo) با مجموع هموزیگوسیتی مورد انتظار برای هر هاپلوتیپ در یک لوکوس (Fe) مقایسه می­گردد. در صورتی که ژنی تحت تأثیر انتخاب خنثی، تکامل یابد، مقدار Fo با  Feبرابر خواهد بود. مقدار  Foو Fe برای هاپلوتیپ BglII-EcoRI در ژن PAH در جمعیت اصفهان برابر با 35/0 و 59/0 تخمین زده شد. از آن جهت که مقدار Fe هاپلوتیپ BglII-EcoRI در ژن PAH در جمعیت اصفهان بزرگتر از مقدار Fo است، بنابراین، می توان نتیجه‌گیری کرد که این هاپلوتیپ در ژن PAH در جمعیت اصفهان تحت تأثیر انتخاب متعادل قرار دارد.

اگر چه نتایج مطالعه حاضر بر روی چندشکلی‌های BglII و EcoRI در ژن PAH می‌تواند درک ما را از تاریخچه تکاملی و ساختار ژنتیکی جمعیت اصفهان افزایش دهد، البته لازم است تا مطالعات بیشتری بر روی ژن­های مختلف در جمعیت اصفهان انجام شود تا بصیرت ما در مورد ساختار ژنتیکی جمعیت اصفهان، که یکی از بزرگترین جمعیت‌های ایران است، افزایش یابد.

 

منابع

Akey, J. M., Eberle, M. A., Rieder, M. J., Carlson, C. S., Shriver, M. D., Nickerson, D. A and Kruglyak, L. (2004) Population history and natural selection shape patterns of genetic variation in 132 genes. PLoS Bioogyl2:286.

Bersaglieri, T., Sabeti, P. C., Patterson, N., Vanderploeg, T., Schaffner, S. F., Drake, J. A., Rhodes, M., Reich, D. E. and Hirschhorn, J. N. (2004) Genetic signatures of strong recent positive selection at the lactase gene. The American Journal of Human Genetics 74:1111-1120.

Carlson, C. S., Thomas, D. J., Eberle, M. A., Swanson, J. E., Livingston, R. J., Rieder, M. J. and Nickerson, D. A (2005) Genomic regions exhibiting positive selection identified from dense genotype data.Genome Research 15: 1553-1565.

Dworniczak, B., Wedemeyer, N. and Horst, J. (1991) PCR detection of the BgIII RFLP at the human phenylalanine hydroxylase (PAH) locus. Nucleic Acids Research 19; 1958.

Fazeli Zahra and Vallian Sadeq (2009) Estimation Haplotype Frequency of BglII/EcoRI/VNTR Markers at the PAH Gene Region in Iranian Population. International Journal of Human Genetics 9(2):115-121.

Hamblin, M. T. and Di Rienzo, A. (2000) Detection of the signature of natural selection in humans: Evidence from the Duffy blood group locus. The American Journal of Human Genetics66:1669-1679.

Hamblin, M. T., Thompson, E. E. and Di Rienzo, A. (2002) Complex signatures of natural selection at the Duffy blood group locus. The American Journal of Human Genetics 70:369-383.

Hughes, A. L. and Yeager, M. (1998) Natural selection and the evolutionary history of major histocompatibility complex loci. Frontiers in Bioscience.3: d509-d516.

Kidd, K. K. 2002. PAH EcoRI Polymorphism. Available: http://info.med.yale.edu/genetics/kkidd/PAH_EcoRI.html.

Kwok, S. C. M., Ledley, F. D., DiLella, A. G., Robson, K. J. H and Woo, S. L. C. (1985) Nucleotide sequence of a full-length complementary DNA clone and amino acid sequence of human phenylalanine hydroxylase. Biochemistry 24: 556- 561.

Libert, F., Cochaux, P., Beckman, G., Samson, M., Aksenova, M., Cao, A., Czeizel, A., Claustres, M., de la Rua, C., Ferrari, M.,Ferrec C., Glover G., Grinde B., Guran S., Kucinskas V., Lavinha J., Mercier B., Ogur G., Peltonen L., Rosatelli C., Schwartz M., Spitsyn V., Timar L., Beckman L. and VassartG. (1998) The deltaccr5 mutation conferring protection against HIV-1 in Caucasian populations has a single and recent origin in Northeastern Europe. Human Molecular Genetics 7:399–406.

Madden, M. (2004) Phenylketonuria: Defects in amino acid metabolism. South Carolina Journal of Molecular Medicine 5: 57-61.

Miller S. A., Dykes D. D. and Polesky H. F. (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research 16: 1215.

Pasternak, J. J. (2005) An introduction to human molecular genetics, mechanisms of inherited diseases. 2nd Ed. John Wiley & Sons, Inc.

Schneider, S., Roesli, D. and Excofier, Y. L. (2000) Arlequin: A software for population genetics data analysis, version 2.000. Genetics and Biometry Laboratory. University of Geneva, Switzerland.

Seltsam, A., Hallensleben, M., Kollmann, A. and Blasczyk, R. (2003) The nature of diversity and diversification at the ABO locus. Blood 102: 3035-3042.

Stajich, J. E. and Hahn, M. W. (2005) Disentangling the effects of demography and selection in human history.Molecular Biology and Evolution 22:63-73.

Tajima, F. (1989) Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism. Genetics 123: 585-595.

Watterson, G. (1978) The homozygosity test of Neutrality. Genetics 88: 405-417.